การสกัดและแยกสารสำคัญ

ตัวอย่างที่ 1 การสกัดและแยกสารสำคัญจากลำต้นของกระแจะโดยนำผงลำต้นของกระแจะ 6.78 กก. มาสกัดด้วย 70% อะซีโตน 20 ลิตร จำนวน 3 ครั้ง รวมสารสกัดที่ได้และระเหยตัวทำละลายออก จะได้สารสกัดหยาบ 300 ก. นำไปกระจายในน้ำ และสกัดด้วยเอทิลอะซิเตท ได้สารสกัด 150 ก. นำไปแยกด้วยเทคนิค column chromatography โดยใช้ silica gel เป็นวัฏภาคคงที่ และ ใช้คลอโรฟอร์ม, คลอโรฟอร์ม/อะซีโตน (9 : 1 และ 4 : 1), และอะซีโตนเป็นวัฏภาคเคลื่อนที่ ในการชะสารออกจาก column(eluent) เก็บและรวบรวมส่วนสกัด (fraction) ที่ได้โดยใช้เทคนิค thin-layer chromatography (TLC) ช่วยในตรวจสอบและรวมส่วนสกัดที่เหมือนกัน 

ส่วนสกัด I (fraction I) ซึ่งได้จากการใช้คลอโรฟอร์มเป็นตัวพาสารออกจาก column เมื่อนำมาแยกซ้ำด้วย silica gel column โดยใช้ ปิโตรเลียมอีเธอร์/เอทิลอะซิเตทเป็นตัวพาสารออกจาก column ได้สาร angustifolin (15 มก.), pimpinellin (8 มก.), moellendorffilin (14 มก.), lupeol (200 มก.), stigmast-4-en-6β-ol-3-one (30 มก.), 3β-hydroxy-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-diene (20 มก.)

ส่วนสกัด II (fraction II) ซึ่งได้จากการใช้คลอโรฟอร์ม/อะซีโตน (9 : 1) เป็นตัวพาสารออกจาก column เมื่อนำมาแยกซ้ำด้วย silica gel column โดยใช้ปิโตรเลียมอีเธอร์/เอทิลอะซิเตท, คลอโรฟอร์ม/อะซีโตน, และคลอโรฟอร์ม/เมทานอลเป็นตัวพาสารออกจาก column ได้สารN-benzoyltyramine methyl ether (9 มก.), tembamid (12 มก.), 2′,4′,5,7-tetrahydroxyflavanone (4 มก.), 3,4′,5,7-hydroxyflavanone(5 มก.),syringaldehyde (16 มก.), 1,3,5-trimethoxybenzene (7 มก.), 7-hydroxycoumarin (5 มก.), limonin (300 มก.), deacetylnomilinate (23 มก.), schleicheol2 (6 มก.), และ syringaresinol (45 มก.)

ส่วนสกัด III (fraction III) ซึ่งได้จากการใช้คลอโรฟอร์ม/อะซีโตน (4 : 1) เป็นตัวพาสารออกจาก column เมื่อนำทำให้บริสุทธิ์ขึ้นด้วย column ที่บรรจุ MCI-gel CHP-20P ใน aqueous methanol และนำสารที่ได้ มาแยกซ้ำด้วย silica gel column โดยใช้คลอโรฟอร์ม/อะซีโตนและคลอโรฟอร์ม/เมทานอลเป็นตัวพาสารออกจาก column จะได้สาร crenulatine (8 มก.), 4-methoxy-6-hydroxy-1-methyl-2-quinolone (15 มก.), limonexin (20 มก.), และ lyoniresinol (11 มก.) (10)

ตัวอย่างที่ 2 การศึกษาเปรียบเทียบปริมาณสาร arbutin ซึ่งเป็นสารออกฤทธิ์ช่วยให้ผิวขาว จากเปลือกต้น ลำต้น ใบ และผลของกระแจะ (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำผงแห้งของเปลือก ลำต้น ใบแห้ง และผลสุกของกระแจะ มาแช่สกัด (maceration) ในเมทานอล นาน 24 ชม. โดยเขย่าด้วยความเร็ว 150 รอบ/นาที ที่อุณหภูมิห้อง นาน 24 ชม. นำสารสกัดที่ได้ไปวิเคราะห์ด้วย HPLC ผลการวิเคราะห์พบว่า สารสกัดเมทานอลจากส่วนต่างๆ ของกระแจะมีปริมาณสาร arbutin เรียงลำดับจากมากไปน้อยดังนี้ สารสกัดจากใบ (2.426 ก./กก.)>สารสกัดจากผล (0.293 ก./กก.) >สารสกัดจากลำต้น (0.260 ก./กก.) >สารสกัดจากเปลือกต้น (0.171 ก./กก.) (18)

การตรวจสอบด้วยวิธี Thin-Layer chromatography (TLC)

ตัวอย่างที่ 3 ตรวจสอบสารสกัด 95% เอทานอลของลำต้นของกระแจะด้วยเทคนิค TLC โดยสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (12)

TLC plate: ไม่ระบุ

Mobile phase: ethyl acetate : methanol (9 : 1)

Sample volume: ไม่ระบุ

Spray reagent: ไม่ระบุ

Reference standard: -

UV detector: UV ที่ความยาวคลื่น 254 นาโนเมตรและ UV ที่ความยาวคลื่น 365 นาโนเมตร

ผลการทดสอบ: ภายใต้ UV254ค่า hRf30, 42, 47, 61, 71, 75, 92 มีจุดสีดำ (quenching) และภายใต้ UV365ค่า hRf 50, 71 มีจุดเรืองแสงสีเขียวอมฟ้า 

ตัวอย่างที่ 4 ตรวจสอบสารสกัด 70% และ 95% เอทานอลของลำต้นของกระแจะด้วยเทคนิค TLC โดยสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (13)

TLC plate: silica gel GF254

Mobile phase: dichloromethane : methanol (95 : 5)

ethyl acetate : toluene : hexane (5 : 4 : 1)

ethyl acetate : dichloromethane : hexane (6 : 2 : 2)

Spray reagent: 10% KOH และ anisaldehyde-sulfuric acid TS

Reference standard: umbelliferone, scopoletin

UV detector: UV ที่ความยาวคลื่น 254 นาโนเมตรและ UV ที่ความยาวคลื่น 366 นาโนเมตร

การตรวจสอบด้วยวิธี High-performance liquid chromatography (HPLC)

ตัวอย่างที่ 5 การตรวจสอบด้วยวิธี HPLC เพื่อวิเคราะห์สาร arbutin มีสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (12, 14)

Column: Prevail C18 (5 มคม.;250 × 4.6 มม.)และ Prevail all-guard cartridge C18(5 มคม.;7.5 × 4.6 มม.)

Mobile phase: acetonitrile : 3% acetic acid inH2O (v/v) ที่เวลา 0 นาที (10:90), ที่เวลา 45 นาที (55:45) และคงอัตราส่วนนี้ไว้

Flow rate: 1 มล./นาที

Injection volumes: ไม่ระบุ

Detector: photodiode array detector ที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร

Reference standard: arbutin

ตัวอย่างที่ 6 เตรียมสารสกัดโดยนำผงแห้ง 6 กก. มาสกัดด้วยน้ำ 5 ลิตร โดยการเขย่าด้วยเครื่อง  wrist action shaker นาน 5 ชม. กรอง นำไประเหยตัวทำละลายออกด้วยเทคนิค spray drying (อุณหภูมิ 100 oC, flow rate: 1.0 มล./นาที) หรือrotatory evaporatorซึ่งจะได้สารสกัดหยาบสีน้ำตาลเข้ม นำสารสกัดที่ได้ 5 ก. มาสกัดด้วย 75% เมทานอล 100 มล. ด้วยวิธีการสกัดแบบไหลย้อนกลับ (reflux extraction) นาน 30 นาที กรอง นำมาระเหยตัวทำละลายจนเหลือประมาณ 12 มล. ถ่ายลงสู่กรวยแยก (separator) ขนาด 250 มล. เติมน้ำ 50 มล.แล้วสกัดด้วยอีเธอร์ 30 มล. 2 ครั้ง นำสารสกัดในชั้นน้ำมาสกัดด้วยเอทิลอะซิเตท 50 มล. 3 ครั้ง รวมสารสกัดในชั้นเอทิลอะซิเตท ระเหยตัวทำละลายออกจนแห้ง นำมาละลายในเมทานอล นำไปวิเคราะห์ด้วย HPLC โดยสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (17)  

Column: ODS Hypersil® C18 column (5 มคม.;125 × 4.0 มม.)และ Lichrosphere® 100 RP-18 (5 มคม.;4.0 × 4.0 มม.)guard column

Mobile phase: water : methanol : 0.1 M hydrochloric acid (89 : 10 : 1, v/v/v)

Flow rate: 1.0 มล./นาที

Injection volumes: 100 มคล.

Detector: UV-visible detector model G 1313 Aที่ความยาวคลื่น 282 นาโนเมตร

ผลการทดสอบ: พบสาร arbutin 0.12 มคก./ก. ของสารสกัดจากลำต้นกระแจะ

ตัวอย่างที่ 7 การวิเคราะห์สาร arbutin ด้วยวิธี HPLC มีสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (19)

Column: Synergi Hydro RP column (4 มคม.; 250 × 4.6 มม.) และ LC-18 guard column (2 ซม.), อุณหภูมิ column 45 oC

Mobile phase: gradient elution ของ water (A) และ methanol (B), ด้วยทั้งสองตัวทำละลายมี 0.1% acetic acid (v/v); ที่เวลา 0 – 14 นาทีใช้ 8% B; ที่เวลา 14–22 นาที ปรับจาก 8% B เป็น 100% B; ที่เวลา 22–30 นาที ใช้ 100% B

Flow rate: 0.5 มล./นาที

Injection volumes: 10 มคล.

Detector: photodiode array detector ที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร

Reference standard: β-arbutin และ α-arbutin

ผลการทดสอบ: Retention timeβ-arbutin 9.28 นาที, α-arbutin 9.68 นาที

การตรวจสอบด้วยวิธี Gas chromatograph-Mass spectrometer (GC-MS)

ตัวอย่างที่ 8 วิเคราะห์สารสกัดเอทานอล (15) และสารสกัดเมทานอล (16) ของลำต้นกระแจะด้วย GC-MS โดยมีสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ

GC-MS model: QP 2010 series, Shimadzu

Capillary column: VF-5ms fused silica capillary column (30ม.x0.25 มม., 0.25 มคม. film thickness)

GC-MS detection: Electron ionization system (ionization energy 70 eV)

Carrier gas: Helium (99.99%)

Flow rate: 1.51 มล./นาที

Injectiontemperature: 200 oC

Mass transfer linetemperature: 240 oC

Temperature of the column: oven temperature program 70 - 220 oC ที่ 10 oC/นาที, คงอยู่ 1 นาที จากนั้นเพิ่มอุณหภูมิเป็น 300 oC ที่ 10 oC/นาที

Sample volume: 2 มคล., split ratio 1 : 40 with mass scan 50- 600 amu 

Total running time: 35 นาที

ผลการทดสอบ: ส่วนประกอบหลักที่พบในสารสกัดเอทานอลได้แก่ hexadecanoic acid (19.65%), lupeol (13.70%), lup-20(30)-en-3-one (12.75%), stigmast-4-en-3-one (8.21%), tetratetracontane (5.97%) และ (7Z)-7-tetradecenal (5.58%) เป็นต้น (15) และส่วนประกอบหลักที่พบในสารสกัดเมทานอลได้แก่ palmitic acid (23.90%), cyclopentadecanone (16.60%), lupeol (9.97%), stearic acid (9.74%), linoleic acid (6.96%), lupenone (4.94%), n-dodecanoic acid (3.86%) เป็นต้น (16)

การศึกษาเพื่อหาแนวทางสำหรับการจัดทำข้อกำหนดมาตรฐานของลำต้นของกระแจะ

เนื่องจากในขณะนี้ยังไม่มีข้อกำหนดมาตรฐานของกระแจะใน Thai Herbal Pharmacopoeia จึงได้รวบรวมการศึกษาที่เกี่ยวข้อง ซึ่งอาจใช้เป็นแนวทางในการกำหนดมาตรฐานเบื้องต้นของกระแจะได้

ตัวอย่างที่ 9 ข้อกำหนดมาตรฐานของลำต้นของกระแจะ (12)

การตรวจสอบพฤกษเคมีเบื้องต้น

การตรวจสอบสารกลุ่มอัลคาลอยด์ 

สารสกัด 95% เอทานอลของกระแจะให้ผลเป็นบวกกับ Dragendorff’s reagent โดยสังเกตพบตะกอนสีส้ม 

การตรวจสอบสารกลุ่มคูมาริน

สารสกัด 95% เอทานอลของกระแจะเรืองแสงสีเขียวอมฟ้าภายใต้แสง UV ความยาวคลื่น 365 นาโนเมตรหลังจากสัมผัสกับสารละลาย NaOH หรืออาจสังเกตเห็นการเรืองแสงสีฟ้าได้ก่อนการ สัมผัสกับสารละลายด่าง

การวิเคราะห์เชิงคุณภาพด้วยวิธีทางกายภาพ

การตรวจหาปริมาณสิ่งแปลกปลอม

ไม่พบสิ่งแปลกปลอม

การวิเคราะห์ปริมาณความชื้น(Azeotropic distillation method) 

ปริมาณความชื้น ค่าเฉลี่ยร้อยละ4.833-7.333

การวิเคราะห์หาน้ำหนักที่หายไปเมื่อทำให้แห้ง

น้ำหนักที่หายไปเมื่อทำให้แห้ง ค่าเฉลี่ยร้อยละ 5.973-9.973

การวิเคราะห์ปริมาณเถ้า

ปริมาณเถ้ารวม ค่าเฉลี่ยร้อยละ 0.658-2.378

ปริมาณเถ้าที่ไม่ละลายในกรด ค่าเฉลี่ยร้อยละ 0.003-0.279

การวิเคราะห์ปริมาณสารสกัดด้วยตัวทำละลาย 

ค่าการสกัดด้วย 95% เอทานอล ค่าเฉลี่ยร้อยละ 0.266-0.105

ค่าการสกัดด้วยเอทิลอะซิเตท ค่าเฉลี่ยร้อยละ 0.025-0.047

ค่าการสกัดด้วยน้ำ ค่าเฉลี่ยร้อยละ 0.381-0.733

ตัวอย่างที่ 10 การวิเคราะห์ทางเคมีเบื้องต้นพบว่าสารสกัดเอทานอลของลำต้นกระแจะประกอบด้วย protein, lipid, carbohydrate, reducing sugar และสารในกลุ่ม phenols, tannins, flavonoids, saponins, alkaloids แต่ไม่พบสารในกลุ่ม anthraquinones, และ quinones (20)

การวิเคราะห์ทางเคมีกายภาพของสารสกัดเอทานอลของลำต้นกระแจะ

การวิเคราะห์ปริมาณเถ้า

ปริมาณเถ้ารวมร้อยละ 9.65%w/w

ปริมาณเถ้าที่ไม่ละลายในกรด 20.0%w/w

ปริมาณเถ้าที่ละลายในน้ำ 48.0%w/w

การวิเคราะห์ปริมาณสารสกัดด้วยตัวทำละลาย 

ค่าการสกัดด้วยเอทานอล 13.0%w/w

การวิเคราะห์ปริมาณเส้นใย (crude fibre content) 6.2%w/w

ปริมาณเส้นใย 6.2%w/w

    ยังไม่มีการรายงานการศึกษาทางคลินิกสำหรับการใช้ประโยชน์ทางด้านเครื่องสำอางของกระแจะ

10. การศึกษาฤทธิ์ทางเภสัชวิทยา

1 การศึกษาเกี่ยวกับผิวหน้า

1.1 ต้านอนุมูลอิสระบนใบหน้า (F007)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดไดคลอโรมีเทนของเปลือกต้นกระแจะจากจังหวัดตาก (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำเปลือกต้นกระแจะ 500 ก. มาแช่สกัด (maceration) ด้วยไดคลอโรมีเทน 1.5 ลิตร นาน 3 วัน กรอง ระเหยตัวทำละลายออกภายใต้ความดันสุญญากาศ นำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) assay พบว่ามีค่าความเข้มข้นที่ออกฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระได้ครึ่งหนึ่ง (EC50) เท่ากับ 316.57มคก./มล. ในขณะที่สารมาตรฐานวิตามินซีมีค่าEC50 เท่ากับ 4.74 มคก./มล. (21)

1.2 ลดเลือนริ้วรอยบนใบหน้า (F008)

การทดสอบประสิทธิภาพในการลดเลือนริ้วรอยของสารสกัดไดคลอโรมีเทนของเปลือกต้นกระแจะจากจังหวัดตาก (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำเปลือกต้นกระแจะ 500 ก. มาแช่สกัดด้วยไดคลอโรมีเทน 1.5 ลิตร นาน 3 วัน กรอง ระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary evaporator นำสารสกัดขนาด 5, 10, 25, 50, และ 100 มคก./มล. มาทดสอบกับเซลล์ไฟโบรบลาสต์ที่แยกได้จากผิวหนังของมนุษย์บริเวณที่เป็นริ้วรอยตรงหน้าผากและ/หรือหางตา จากอาสาสมัครอายุตั้งแต่ 50 ปีขึ้นไป โดยการทดสอบผลต่อการเพิ่มจำนวนของเซลล์ด้วยวิธีsodium 3′-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid hydrate (XTT)assay พบว่าสารสกัดทุกขนาดไม่มีผลต่อการแบ่งตัวหรือรูปร่างของเซลล์ และไม่ก่อให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ การทดสอบฤทธิ์กระตุ้นการสร้างโปรคอลลาเจน(type I procollagen) และฤทธิ์ยับยั้งการผลิตเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการสลายคอลลาเจนหรือ matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) โดยเซลล์จะได้รับสารสกัด 24 ชม. จากนั้นจึงล้างสารสกัดออกด้วย phosphate buffer saline (PBS) และเติม PBS เข้าไปใหม่ นำมาฉายรังสี UVB ขนาด 56 วัตต์ นาน 30 นาที นำ PBS ออก และเติมอาหารเลี้ยงเซลล์ (medium) เข้าไป วิเคราะห์ผลหลังจากนั้น 4 และ 24 ชม. พบว่าที่เวลา 4 ชม. สารสกัดขนาด 25, 50, และ100 มคก./มล. สามารถลดปริมาณของ MMP-1ได้อย่างชัดเจน เมื่อเทียบกับเซลล์ที่ได้รับการฉายรังสี UVB เพียงอย่างเดียว แต่ที่เวลา 24 ชม. สามารถลดปริมาณของ MMP-1ได้เพียงเล็กน้อย และให้ผลไม่ชัดเจน เมื่อเทียบกับเซลล์ที่ได้รับการฉายรังสี UVB และการทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดต่อการฟื้นฟูศักยภาพในการจัดระเบียบเส้นใยคอลลาเจนและการหดตัวของเซลล์ พบว่าสารสกัดความเข้มข้น 100 มคก./มล.  ไม่มีประสิทธิภาพในการเพิ่มความสามารถในการฟื้นฟูศักยภาพในการจัดระเบียบเส้นใยคอลลาเจนและการหดตัวของเซลล์ไฟโบรบลาสต์ เมื่อศึกษาเป็นเวลา 3 วัน โดยคาดว่าหากเพิ่มระยะเวลาการศึกษาเป็น 7 วันอาจเห็นความแตกต่างที่ชัดเจนกว่านี้ ในขณะที่การทดสอบผลต่อtype I procollagen พบว่า ที่เวลา 24 ชม. สารสกัดขนาด 10, 25, 50, และ100 มคก./มล. สามารถทำให้ระดับของtype I procollagenเพิ่มขึ้นอย่างชัดเจน เมื่อเทียบกับเซลล์ที่ได้รับการฉายรังสี UVB เพียงอย่างเดียว แสดงให้เห็นว่าสารสกัดไดคลอโรมีเทนของลำต้นของกระแจะอาจช่วยลดเลือนริ้วรอยบนผิวหนังที่ถูกทำลายด้วยรังสี UVB ได้ (21, 22)

2 การศึกษาเกี่ยวกับผิวกาย

2.1 ทำให้ผิวขาว (S001)

การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนส (tyrosinase) ซึ่งเป็นเอนไซม์หนึ่งในกระบวนการสร้างเม็ดสีผิว ของสารสกัดของเปลือกต้นกระแจะจากประเทศพม่า (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำเปลือกต้นมาบดเป็นผง นำผงสมุนไพรที่ได้ 3 กก. มาสกัดลําดับส่วน (sequential extraction) ด้วยวิธีแช่สกัด (maceration) ที่อุณหภูมิห้อง กับตัวทำละลายเฮกเซนไดคลอโรมีเทนเอทิลอะซิเตท และเมทานอลตามลำดับ โดยใช้ตัวทำละลาย 9 ลิตร และนำผงสมุนไพร 1 กก. มาสกัดด้วย 85% เอทานอล และน้ำกลั่นขนาด 3 ลิตร ด้วยวิธีเดียวกัน (ไม่ระบุระยะเวลาในการสกัด) กรอง และระเหยตัวทำละลายด้วยการลดความดัน ซึ่งจะได้สารสกัด 6 ชนิดคือ สารสกัดเฮกเซนสารสกัดไดคลอโรมีเทน สารสกัดเอทิลอะซิเตทสารสกัดเมทานอล สารสกัด 85% เอทานอล และสารสกัดน้ำ นำสารสกัดทั้งหมดมาทดสอบฤทธิ์ด้วยวิธี tyrosinase inhibition assay พบว่าสารสกัดทั้ง 6 ชนิดมีค่าความเข้มข้นที่สามารถยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสได้ครึ่งหนึ่ง (IC50) เท่ากับ 0.623, 0.546, 0.697, 1.420, 0.860, และ 1.089 มก./มล. ตามลำดับ ซึ่งจะเห็นว่าสารสกัดไดคลอโรมีเทนมีฤทธิ์ดีที่สุดในขณะที่สารมาตรฐาน kojic acidมีค่า IC50เท่ากับ 0.009 มก./มล. (23)

2.2 ต้านอนุมูลอิสระบนผิวกาย (S006)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดเมทานอลของเปลือกต้นกระแจะจากจังหวัดตาก (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำเปลือกต้นมาสกัดด้วยวิธีแช่สกัดในเมทานอล ที่อุณหภูมิห้อง นาน 1 สัปดาห์ กรอง และระเหยตัวทำละลายภายใต้สุญญากาศที่อุณหภูมิ 35 oC นำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธีDPPH assay พบว่าสารสกัดเมทานอลของเปลือกต้นกระแจะ มีค่า EC50เท่ากับ 135.07 มคก./มล. ในขณะที่สารมาตรฐานวิตามินอีมีค่า EC50เท่ากับ 11.09 มคก./มล. (24)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดเมทานอลของเปลือกต้นกระแจะ (ไม่ระบุแหล่งที่มา voucher specimen และวิธีสกัด) ด้วยวิธี DPPH พบว่ามีค่า EC50 เท่ากับ 146.1มคก./มล. ในขณะที่สารมาตรฐานวิตามินอีมีค่าEC50 เท่ากับ 11.1 มคก./มล. (25)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดของเปลือกต้นกระแจะจากประเทศพม่า (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำเปลือกต้นมาบดเป็นผง นำผงสมุนไพรที่ได้ 3 กก. มาสกัดลําดับส่วน (sequential extraction) ด้วยวิธีแช่สกัด ที่อุณหภูมิห้อง กับตัวทำละลายเฮกเซนไดคลอโรมีเทนเอทิลอะซิเตท และเมทานอลตามลำดับ โดยใช้ตัวทำละลายขนาด 9 ลิตร และนำผงสมุนไพร 1 กก. มาสกัดกับ 85% เอทานอล และน้ำกลั่นขนาด 3 ลิตร ด้วยวิธีเดียวกัน (ไม่ระบุระยะเวลาในการสกัด) กรอง และระเหยตัวทำละลายด้วยการลดความดัน ซึ่งจะได้สารสกัด 6 ชนิดคือ สารสกัดเฮกเซนสารสกัดไดคลอโรมีเทน สารสกัดเอทิลอะซิเตทสารสกัดเมทานอล สารสกัด 85% เอทานอล และสารสกัดน้ำ นำมาทดสอบฤทธิ์ด้วยวิธี DPPH assay พบว่าสารสกัดทั้ง 6 ชนิดมีค่าความเข้มข้นที่สามารถต้านอนุมูลอิสระได้ครึ่งหนึ่ง (SC50) เท่ากับ <2, 0.554, 0.320, 0.351, 0.282, และ 0.425 มก./มล. ตามลำดับ ซึ่งจะเห็นว่าสารสกัด 85% เอทานอลมีฤทธิ์ดีที่สุดในขณะที่สารมาตรฐาน trolox และ quercetin มีค่า SC50เท่ากับ 0.027 และ 0.016 มก./มล. ตามลำดับ (23)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดเอทานอลของลำต้นของกระแจะจากประเทศพม่า (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำลำต้นของกระแจะมาสับหรือหั่นให้มีขนาดเล็ก อบที่อุณหภูมิไม่เกิน 60oC นำมาบดให้ละเอียด สกัดโดยนำผงสมุนไพร 50 มก. ไปเขย่ากับ 95%, 85%, 70%, หรือ 50% เอทานอล 150 มล. ด้วยเครื่องเขย่านาน 15 นาที กรอง ระเหยตัวทำละลายบน water bath  ทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay พบว่าสารสกัด 95%, 85%, 70%, และ 50% เอทานอล มีค่าความเข้มข้นที่ออกฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระได้ครึ่งหนึ่ง (ED50) เท่ากับ 45.74, 51.03, 21.56, และ 47.85 มคก./มล. ตามลำดับ ซึ่งจะเห็นว่าสารสกัด 70% เอทานอลแสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดีที่สุด ในขณะที่สารมาตรฐาน vitamin C, butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), umbelliferone, และ scopoletin มีค่า ED50 เท่ากับ2.02, 5.33, 18.57, 69.78, และ112.69 มคก./มล. ตามลำดับ และเมื่อนำสารสกัด 70% เอทานอลไปเตรียมเป็นผลิตภัณฑ์ในรูปแบบโลชันโดยใช้สารสกัดขนาด 0.5%, 1%, และ 2% และนำไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระอีกครั้ง พบว่าโลชันที่เตรียมได้มีค่าED50เท่ากับ 55.86, 23.32 และ 12.90 มคก./มล. ตามลำดับ ซึ่งจะเห็นว่าการใส่สารสกัดกระแจะขนาด 2% มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดีที่สุด แต่ที่ขนาดดังกล่าวทำให้ผลิตภัณฑ์มีสีเข้มมาก และไม่เป็นที่ยอมรับทางเครื่องสำอาง ทางคณะผู้วิจัยจึงเตรียมโลชันโดยใช้สารสกัด กระแจะขนาด 1% (มีสารumbelliferone และ scopoletin 0.28 มก.% และ 0.51 มก.% ตามลำดับ) ซึ่งให้สีที่ยอมรับได้และมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ดีในการพัฒนาผลิตภัณฑ์ต่อไป (13)

2.3 กันแดดสำหรับผิวกาย (S008)

การทดสอบวัดค่าการป้องกันแสงแดด (sun protecting factor; SPF) ของโลชันที่มีส่วนผสมของสารสกัด 70% เอทานอลของลำต้นของกระแจะจากประเทศพม่า (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำลำต้นของกระแจะมาสับให้มีขนาดเล็ก อบที่อุณหภูมิไม่เกิน 60oC นำมาบดให้ละเอียด สกัดโดยนำผงสมุนไพร 50 มก. ไปเขย่ากับ 70%เอทานอล 150 มล. ด้วยเครื่องเขย่านาน 15 นาที กรอง ระเหยตัวทำละลายบน water bath  นำสารสกัดที่ได้ไปเตรียมเป็นผลิตภัณฑ์ในรูปแบบโลชันโดยใช้สารสกัดขนาด 1% (มีสาร umbelliferone และ scopoletin 0.28 มก.% และ 0.51 มก.% ตามลำดับ) และนำไปทดสอบวัดค่าการป้องกันแสงแดด(sun protecting factor; SPF) โดยเครื่อง SPF290S พบว่าโลชันดังกล่าวมีค่า SPF 1.25 (13)

การทดสอบฤทธิ์ปกป้องผิวจากรังสีUV ของผลิตภัณฑ์รองพื้นเนื้อน้ำ (liquid foundation) ซึ่งมีส่วนผสมของกระแจะ (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen), titanium dioxide (TiO2) และว่านหางจระเข้ ด้วยการหาค่า sun protection factor (SPF), UVA/UVB ratio, critical wavelength, และ boots star rating โดยกระจายผงกระแจะ (ผงจากลำต้นและผงจากเปลือกต้น), TiO2, และผงว่านหางจระเข้ใน propylene glycol หรือน้ำที่ขนาดความเข้มข้น 60%w/w พบว่าค่า SPF ของผงจากเปลือกต้นของกระแจะสูงกว่าผงว่านหางจระเข้และผงจากลำต้นของกระแจะ แต่ต่ำกว่า TiO2แม้ว่าค่า UVA/UVB ratio, boots star rating และ critical wavelength ของผงจากลำต้นจะดีกว่าผงจากเปลือกต้น แต่การกระจายตัวและเนื้อสัมผัสของผงจากเปลือกต้นดีกว่าผงจากลำต้น ทางผู้วิจัยจึงเลือกผงจากเปลือกต้นมาพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์โดยมีส่วนผสมของผงจากเปลือกต้นกระแจะ 10% w/w, TiO2 12% w/w, และว่านหางจระเข้ 2% w/w (เป็นสัดส่วนที่ให้ค่า SPF สูงสุด) เมื่อนำมาทดสอบประสิทธิภาพในการป้องกันรังสีพบว่าผลิตภัณฑ์ดังกล่าวมีค่า SPF เท่ากับ 35.467มีค่า UVA/UVB ratio เท่ากับ 0.98 มีค่า critical wavelength เท่ากับ 387.90นาโนเมตร และมีค่า boots star rating เท่ากับ 5 (26) 

ค่าความสามารถในการป้องกันแสงแดดของผลิตภัณฑ์เครื่องสำอางที่มีสารป้องกันแสงแดด

Critical wavelength (λc) คือ ค่าความยาวคลื่นที่สามารถให้การป้องกันแสง UV ได้ 90% เมื่อคิดจากพื้นที่ใต้กราฟ โดยประเมินแสงในช่วงความยาวคลื่นของ UVB และ UVA คือ 290 ถึง 400 นาโนเมตร เป็นค่าที่บอกประสิทธิภาพในการป้องกันรังสี โดยจะต้องมีค่ามากกว่าหรือเท่ากับ 370 นาโนเมตร (27)

Sun Protection Factor (SPF) คือ ค่าที่แสดงถึงความสามารถของผลิตภัณฑ์ในการป้องกันการไหม้แดงของผิวหนังที่เกิดจากการสัมผัสรังสีUVB (รังสีUV ที่มีความยาวคลื่น 290-320 นาโนเมตร)

ตารางที่ 1 ค่าความสามารถในการป้องกันรังสีUVB (28)

Boots Star Ratingคือ ค่าความสามารถในการป้องกันรังสี UVA (รังสีUV ที่มีความยาวคลื่น 320-400 นาโนเมตร)

ตารางที่ 2 ค่า Boots Star Rating ในการแสดงค่าความสามารถในการป้องกันรังสีUVA (28)

2.4 ต้านการอักเสบของผิวกาย

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดของเปลือกต้นกระแจะจากประเทศพม่า (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำเปลือกต้นมาบดเป็นผง นำผงสมุนไพรที่ได้ 3 กก. มาสกัดลําดับส่วน (sequential extraction) ด้วยวิธีแช่สกัด ที่อุณหภูมิห้อง กับตัวทำละลายเฮกเซนไดคลอโรมีเทนเอทิลอะซิเตทเมทานอลตามลำดับ โดยใช้ตัวทำละลายขนาด 9 ลิตร และนำผงสมุนไพร 1 กก. มาสกัดกับ 85% เอทานอล และน้ำกลั่นขนาด 3 ลิตร ด้วยวิธีเดียวกัน (ไม่ระบุระยะเวลาในการสกัด) กรอง และระเหยตัวทำละลายด้วยการลดความดัน ซึ่งจะได้สารสกัด 6 ชนิดคือ สารสกัดเฮกเซนสารสกัดไดคลอโรมีเทน สารสกัดเอทิลอะซิเตทสารสกัดเมทานอล สารสกัด 85% เอทานอล และสารสกัดน้ำ นำมาทดสอบฤทธิ์ด้วยวิธี nitrite assay กับเซลล์ macrophage ชนิด RAW 264.7 ซึ่งถูกเหนี่ยวนำให้เกิดการอักเสบและกระตุ้นการสร้าง nitric oxide (NO) ด้วยสาร lipopolysaccharides (LPS) โดยใช้สารสกัดความเข้มข้น 0-3 มก./มล.พบว่า สารสกัดทั้ง 6 ชนิดสามารถยับยั้งการสร้าง NO ได้อย่างชัดเจน โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้ และมีลำดับการออกฤทธิ์ดังนี้ สารสกัดเฮกเซน >สารสกัดไดคลอโรมีเทน >สารสกัดเอทิลอะซิเตท >สารสกัด 85% เอทานอล >สารสกัดเมทานอล >สารสกัดน้ำ และสารสกัดทั้ง 6 ชนิดที่ขนาด 0.2-3.0 มก./มล.แสดงฤทธิ์ต้านการอักเสบ 80-90% ซึ่งขนาดดังกล่าวเป็นขนาดที่ไม่ก่อให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ (เซลล์มีชีวิตรอด 80%) (23)

การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารสกัดไดคลอโรมีเทนของลำต้นของกระแจะจากจังหวัดตาก (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำเปลือกต้นของกระแจะมาบดให้เป็นผง และแช่สกัดด้วยไดคลอโรมีเทนนาน 1 สัปดาห์ นำมาระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary evaporator โดยทำการทดสอบกับเซลล์ผิวหนังของมนุษย์ชนิด fibroblasts และเซลล์ผิวหนังชนิด keratinocytes (HaCat) ที่ได้รับการฉายรังสี UVB (56 วัตต์ นาน 30 นาที) ด้วยวิธี XTT assay โดยใช้สารสกัดความเข้มข้น 5, 10, 20, 40, 80 และ 100 มคก./มล. พบว่าสารสกัดทุกขนาดไม่ก่อให้เกิดความผิดปกติกับเซลล์ทั้งสอง ชนิด แสดงให้เห็นว่าสารสกัดไดคลอโรมีเทนของลำต้นของกระแจะที่ขนาดความเข้มข้นสูง(100 มคก./มล.) ไม่เป็นพิษต่อเซลล์ผิวหนัง (22)

ยังไม่มีรายงานข้อห้ามใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง

ยังไม่มีรายงานข้อควรระวังการใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง แต่สำหรับผู้ที่มีประวัติการแพ้ ส้ม มะนาวแก้ว มะตูม หรือพืชในวงศ์ RUTACEAE ควรระมัดระวังการใช้ เนื่องจากเป็นพืชวงศ์เดียวกัน อาจทำให้เกิดอาการแพ้ได้

ยังไม่มีรายงานอาการไม่พึงประสงค์จากการใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง

ไม่มีข้อมูล เนื่องจากยังไม่มีรายงานการศึกษาในคน มีแต่การศึกษาในหลอดทดลองหรือสัตว์ทดลอง

DIP (THAILAND-TH)