วิธีสกัดสารสำคัญ 

ตัวอย่างที่ 1 การทดสอบเปรียบเทียบตัวทำละลายที่เหมาะสมสำหรับการใช้เพื่อสกัดสารสำคัญในกลุ่ม rhinacanthins จากใบทองพันชั่งโดยนำผงแห้งของใบทองพันชั่ง 5 ก. มาแช่สกัด (maceration) ในคลอโรฟอร์ม, เอทิลอะซิเตท, ไดคลอโรมีเทน, เอทานอล, และเมทานอลขนาด 50 มล. นาน 3 วัน นำกากมาสกัดซ้ำอีก 2 ครั้ง รวมสารสกัดที่ได้และนำมาทำให้แห้งด้วยการลดความดัน จากนั้นนำมาวิเคราะห์ปริมาณสารสำคัญด้วย High-performance liquid chromatography (HPLC) โดยมีTSK-gel ODS-80Ts เป็นวัฏภาคคงที่ (stationary phase) และมีmethanol : 5% aqueous acetic acid (80:20, v/v) เป็นวัฏภาคเคลื่อนที่ (mobile phase) (19) จากผลการวิเคราะห์พบว่า ปริมาณสารสกัดหยาบที่ได้จากการสกัดด้วยตัวทำละลายต่างๆ เรียงลำดับจากมากไปน้อยดังนี้ เมทานอล (18.4 %w/w) > เอทานอล (11.5 %w/w) > คลอโรฟอร์ม(4.9 %w/w) > เอทิลอะซิเตท (4.8 %w/w) > ไดคลอโรมีเทน (3.7 %w/w) ในขณะที่ค่าผลรวมปริมาณ rhinacanthin ที่ได้จากการสกัดด้วยตัวทำละลายต่าง ๆ เรียงลำดับจากมากไปน้อยดังนี้ เอทิลอะซิเตท (33.0 %w/w) >คลอโรฟอร์ม (14.3 %w/w) >ไดคลอโรมีเทน (11.7 %w/w) >เมทานอล  (6.7 %w/w) > เอทานอล (5.4 %w/w) ซึ่งจะเห็นได้ว่า การสกัดด้วยเมทานอลจะทำให้ได้ปริมาณสารสกัดหยาบมากที่สุด แต่การสกัดด้วยเอทิลอะซิเตทจะทำให้ได้สารสำคัญในกลุ่ม rhinacanthins มากที่สุด (19)  

ตัวอย่างที่ 2 นำใบทองพันชั่งมาอบในตู้อบลมร้อน (hot air oven) อุณหภูมิ 50 oC จนแห้ง บดให้ละเอียด นำผงแห้ง 2 กก. มาสกัดด้วยวิธีแช่สกัดในเอทิลอะซิเตท 8 ลิตร นาน 4 วัน นำส่วนกากมาสกัดซ้ำอีก 2 ครั้ง รวมสารสกัดที่ได้และนำมาทำให้แห้งด้วยสุญญากาศ (12) วิเคราะห์ปริมาณสารสำคัญด้วย HPLC (19)  

ตัวอย่างที่ 3 นำใบทองพันชั่งมาอบให้แห้งในตู้อบลมร้อนที่อุณหภูมิ 50-60 oC นาน 48 ชม. บดให้ละเอียด นำผงแห้งของใบทองพันชั่ง 200 ก. มาเติมเอทิลอะซิเตทพอท่วม สกัดด้วยวิธีสกัดแบบไหลย้อนกลับ (reflux) นาน 1 ชม. กรอง และระเหยตัวทำละลายออกจนหมด วิเคราะห์ปริมาณสารสำคัญด้วยด้วยเครื่อง Thin-Layer chromatography (TLC) densitometer (10)

ตัวอย่างที่ 4 นำใบทองพันชั่งมาอบให้แห้งในตู้อบลมร้อนที่อุณหภูมิ 50 oC บดให้ละเอียด นำผงแห้งของใบทองพันชั่ง 100 มก. มาสกัดด้วยวิธีสกัดแบบไหลย้อนกลับในเอทิลอะซิเตท 20 มล. นาน 1 ชม. กรองและทำให้เข้มข้นด้วยการลดความดันนำสารสกัดเอทิลอะซิเตทที่ได้มาละลายในเมทานอล 10 มล. แล้ววิเคราะห์ปริมาณสารสำคัญทันทีด้วยวิธี HPLC (19)  

ตัวอย่างที่ 5 ชั่งผงใบทองพันชั่ง 100 ก. ใส่ใน beaker ขนาด 1 ลิตร เติม polyethylene glycol 400 (PEG 400) 500 มิลลิลิตร จากนั้นคนให้เข้ากัน นำbeaker วางในเครื่องไมโครเวฟ (สกัดครั้งละ 3 beakers) ให้อยู่ในตำแหน่งที่สมมาตรกัน ใช้เครื่องไมโครเวฟที่มีกำลังไฟฟ้า 800-900 วัตต์ เปิดให้เครื่องทำงานนาน 4-5 นาที ควบคุมอุณหภูมิในการสกัดให้อยู่ในช่วง 70-80 องศาเซลเซียส นำสารสกัดที่ได้มากรองผ่านกระดาษกรองหยาบ จะได้สารสกัดใบทองพันชั่งใน PEG 400 (20) และนำไปวิเคราะห์ปริมาณ rhinacanthin-C ด้วย HPLC (19) สารสกัดที่ได้นี้สามารถนำไปเตรียมตำรับยาทิงเจอร์ทองพันชั่งและแชมพูสารสกัดใบทองพันชั่งได้ (20)

ตัวอย่างที่ 6 การศึกษาเพื่อหาวิธีการสกัด ตัวทำละลาย และอัตราส่วนของสมุนไพรและตัวทำละลายที่เหมาะสม สำหรับการสกัดสาร rhinacanthin-C จากใบทองพันชั่ง ซึ่งเตรียมสมุนไพรโดยนำใบทองพันชั่งมาอบให้แห้งด้วยตู้อบลมร้อน อุณหภูมิ 50 oC นาน 24 ชม. บดให้ละเอียด เก็บในภาชนะปิดสนิทและป้องกันแสง (21)

1. เปรียบเทียบวิธีการสกัด: ทำการเปรียบเทียบระหว่าง วิธีแช่สกัด (maceration) วิธีใช้ความร้อน (heat assisted extraction) และวิธีสกัดด้วยไมโครเวฟ (microwave assisted extraction) ซึ่งจัดเป็น green extraction method 

• การสกัดด้วยวิธีแช่สกัด นำผงใบทองพันชั่งมาแช่สกัดในตัวทำละลายต่างๆ ที่อุณหภูมิห้อง โดยตั้งบนเครื่องเขย่าที่มีการเหวี่ยง 125 รอบ/นาที นาน 24 หรือ 72 ชม. กรอง เก็บในภาชนะปิดสนิทและป้องกันแสง 

• การสกัดด้วยวิธีใช้ความร้อน นำผงใบทองพันชั่งใส่ในหลอดทดลองเติมตัวทำละลายต่างๆ ให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 80oC นาน 1 ชม. กรอง เก็บในภาชนะปิดสนิทและป้องกันแสง 

• การสกัดด้วยไมโครเวฟ นำผงใบทองพันชั่งใส่ในภาชนะที่เหมาะสมหรือ beaker เติมตัวทำละลายต่างๆ  ใส่ในเครื่องไมโครเวฟที่มีความถี่ 2450 MHz กำลังไฟฟ้า 600 W (สำหรับสมุนไพร 15 ก. ต่อตัวทำละลาย 100 มล. ใช้เวลา 1 และ 2 นาที และสำหรับสมุนไพร 90 ก. ต่อตัวทำละลาย 600 มล. ใช้เวลา 7 นาที และ 8 นาที 30 วินาที) กรอง เก็บในภาชนะปิดสนิทและป้องกันแสง 

2. เปรียบเทียบตัวทำละลาย: ทำการเปรียบเทียบระหว่าง เอทานอล, propylene glycol, glycerol, propylene glycol ในเอทานอล (25, 50, 75 %v/v), และ glycerol ในเอทานอล (25, 50, 75%v/v)

3. เปรียบเทียบอัตราส่วนของสมุนไพรและตัวทำละลาย: ทำการเปรียบเทียบระหว่างผงใบทองพันชั่งขนาด 5, 10, และ 15 ก. ต่อตัวทำละลาย25% glycerol ในเอทานอล ขนาด 100 มล.

เมื่อทำการวิเคราะห์ปริมาณสาร rhinacanthin-C ด้วยวิธี HPLC (19) พบว่า วิธีสกัดที่ทำให้ได้สาร rhinacanthin-C มากที่สุดคือวิธีสกัดด้วยไมโครเวฟตัวทำละลายที่ดีที่สุดคือ 25% glycerol ในเอทานอลและอัตราส่วนของสมุนไพรต่อตัวทำละลายที่ดีที่สุดคือ 15: 100 (การสกัดโดยใช้สมุนไพร 90 ก. ต่อตัวทำละลาย 600 มล. ที่เวลา 8 นาที 30 วินาทีให้ปริมาณสาร rhinacanthin-C มากกว่าการใช้สมุนไพร 15 ก. ต่อตัวทำละลาย 100 มล. ที่เวลา 2 นาที) (21)

วิธีแยกสารสำคัญ

ตัวอย่างที่ 1 นำสารสกัดเอทิลอะซิเตทของใบทองพันชั่งที่ได้จากสกัดด้วยวิธีสกัดแบบไหลย้อนกลับ มาแยกโดย vacuum chromatography โดยใช้ silica gel เป็นวัฏภาคคงที่ และใช้คลอโรฟอร์มเป็นวัฏภาคเคลื่อนที่ นำสารสกัดที่แยกได้ใน fraction ที่ 9-12 มาแยกต่อด้วย gel filtration chromatography 2 ครั้ง โดยใช้ Sephadex LH-20 เป็นวัฏภาคคงที่ และใช้เมทานอลเป็นวัฏภาคเคลื่อนที่ จะได้สาร rhinacanthin-C ซึ่งมีลักษณะเป็นของเหลวสีเหลือง นำมาวิเคราะห์โครงสร้างสารด้วยเทคนิค NMR (1H NMR และ 13C NMR) (10)

ตัวอย่างที่ 2 นำสารสกัดเอทิลอะซิเตทของใบทองพันชั่งซึ่งสกัดด้วยวิธีสกัดแบบไหลย้อนกลับมาแยกสารบริสุทธิ์ด้วย silica gel column โดยใช้คลอโรฟอร์มเป็นตัวพาสารออกจาก column (eluent) ซึ่งสามารถแยกส่วนสกัดได้ 40 ส่วน ส่วนละ 75 มล. รวมfractions ที่ 9-12 จากนั้นนำมาแยกด้วย Sephadex LH-20 column โดยใช้เมทานอลเป็นตัวพาสารออกจาก column ซึ่งสามารถแยก fractions ได้ 9 ส่วน (I - IX) ส่วนละ 20มล.รวมfractions ที่ II - V แยกด้วย Sephadex LH-20 column เดิมอีกครั้ง ซึ่งจะได้สารที่มีลักษณะคล้ายน้ำมันสีเหลือง (Rn-1) และผลึกสีแดง (Rn-2) รวม fractions ที่ 16-19 จากนั้นนำมาแยกด้วย Sephadex LH-20 column โดยใช้เมทานอลเป็นตัวพาสารออกจาก column ซึ่งสามารถแยก fractions ได้ 7 ส่วน (I - VII)ส่วนละ 50มล. รวม fractions ที่ V - VI แยกด้วย Sephadex LH-20 column เดิมอีกครั้ง ซึ่งจะได้ผลึกสีเหลือง (Rn-3) การวิเคราะห์ด้วยเทคนิค IR spectra, 1H-NMR spectra, และ 13C-NMR spectra พบว่า Rn-1, Rn-2, และ Rn-3 คือ rhinacanthin-C, rhinacanthin-N, และ rhinacanthin-D ตามลำดับ (22)  

ตัวอย่างที่ 3 นำสารสกัดเอทิลอะซิเตทของใบทองพันชั่งที่สกัดด้วยวิธีแช่สกัดมาแยกสารบริสุทธิ์ด้วยเทคนิค ion exchange chromatographyโดยเริ่มจากเตรียม resin โดยเติมเมทานอล 250 มล. ลงใน Amberlite IRA-67 (anion exchange resin) ขนาด 500 ก. คนเบา ๆ ให้เข้ากัน ตั้งทิ้งไว้ 15 นาที เทเมทานอลออก ล้าง resin ด้วยน้ำกลั่น 250 มล. 2 ครั้ง ทิ้งไว้ 5-10 นาที เท resin ที่ได้ลงในcolumn แก้ว (glass column) ขนาด 5 x 35 ซม. ปล่อยเมทานอลส่วนเกินทิ้งไป เติมเมทานอล 200 มล. ลงใน column เพื่อให้ resin นอนก้น จากนั้นจึงเตรียมสารสกัด โดยนำสารสกัดเอทิลอะซิเตท 5 ก. มาละลายในเมทานอล 200 มล. กรอง จากนั้นนำไปใส่ (load) ในcolumn ปล่อยให้ไหลด้วยอัตราเร็ว 1.5 มล./นาที จนหมด จากนั้นล้าง column (elute) ด้วยเมทานอลจนสารสีเขียว (green pigment) หรือ chlorophyll ออกมาหมด ซึ่งสาร rhinacanthins จะยังอยู่ใน column จากนั้นล้าง column ด้วยกรดอะซิตริกในเมทานอลความเข้มข้น 10% (10% acetic acid in methanol) ด้วยอัตราเร็ว 2 มล./นาที นำสารที่ได้มาทำให้แห้งด้วยการลดความดัน ซึ่งจะทำให้ได้สารสกัดที่มี rhinacanthin ในปริมาณสูง (rhinacanthin-rich extract;HRn) (12, 19) จากนั้นนำมาวิเคราะห์ด้วย HPLC (19) จากผลการวิเคราะห์เปรียบเทียบปริมาณ rhinacanthinsระหว่างสารสกัดเอทิลอะซิเตทและสารสกัด HRn พบว่า สารสกัดเอทิลอะซิเตทมีปริมาณ rhinacanthin-C 34.5%w/w, rhinacanthin-D 1.8%w/w, rhinacanthin-N 1.1%w/w และมีผลรวม rhinacanthins เท่ากับ 37.4%w/w ในขณะที่ สารสกัด HRn มีปริมาณ rhinacanthin-C 66.4%w/w, rhinacanthin-D 7.5%w/w, rhinacanthin-N 3.6%w/w และมีผลรวม rhinacanthins เท่ากับ 77.5%w/w ซึ่งจะเห็นว่า สารสกัดHRn มีปริมาณของสารrhinacanthin เพิ่มขึ้น และมีผลรวมปริมาณ rhinacanthins มากกว่า 70% (19)  

การตรวจสอบและการวิเคราะห์ปริมาณสารสำคัญ

การตรวจสอบด้วยวิธี Thin-Layer chromatography (TLC)

ตัวอย่างที่ 1 ตรวจสอบสาร naphthoquinone ในสารสกัดเอทิลอะซิเตทของใบทองพันชั่งด้วยเทคนิค TLC โดยสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (10)

TLC plate: silica gel GF254

Mobile phase: chloroform : ethyl acetate (19.5 : 0.5)

Sample volume: 20 มคล.

Spray reagent: 20% NaOH

Reference standard: rhinacanthin-C

ผลการทดสอบ: พบแถบสีชมพูแดงบริเวณที่มีค่า hRf ตรงกับสาร rhinacanthin-C 

ตัวอย่างที่ 2 ตรวจสอบสาร umbelliferone และสาร lupeol ในสารสกัด 80% เอทานอลของใบทองพันชั่งด้วยเทคนิค TLC โดยสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (23) 

TLC plate: silica gel GF254

Mobile phase: dichloromethane : methanol (90 : 10)

Sample volume: 5 มคล.

Spray reagent: 10% KOH และ anisaldehyde/sulfuric acid

Reference standard: umbelliferone, lupeol

UV detector: UV ที่ความยาวคลื่น 254 นาโนเมตรและ UV ที่ความยาวคลื่น 365 นาโนเมตร

ผลการทดสอบ: พบแถบสารทั้งหมด 6 แถบ (hRf = 16, 35, 52, 58, 77, 84) ซึ่งเป็นแถบสารหลัก 2 แถบ (hRf = 16, 52) ที่เรืองแสงสีฟ้าเมื่อตรวจสอบภายใต้แสง UV ความยาวคลื่น 365 นาโนเมตร และเรืองแสงสีฟ้ามากขึ้นเมื่อพ่นด้วย 10% KOH และตรวจสอบภายใต้แสง UV ความยาวคลื่น 365 นาโนเมตร และแถบสาร hRf = 52 คือ สาร umbelliferone (ค่า hRf ตรงกับสารเปรียบเทียบ umbelliferone) สารเปรียบเทียบ lupeol มีค่า hRf = 68 

ตัวอย่างที่ 3ตรวจสอบสารumbelliferone ในสารสกัด 80% เอทานอลของใบทองพันชั่งด้วยเทคนิค TLC โดยสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (23) 

TLC plate: silica gel GF254

Mobile phase: hexane : ethyl acetate (40 : 60)

Sample volume: 5มคล.

Spray reagent: 10% KOH และ anisaldehyde/sulfuric acid

Reference standard: umbelliferone

UV detector: UV ที่ความยาวคลื่น 254 นาโนเมตรและ UV ที่ความยาวคลื่น 365 นาโนเมตร

ผลการทดสอบ: พบแถบสารหลัก 2 แถบ (hRf = 10, 36) ที่เรืองแสงสีฟ้าเมื่อตรวจสอบภายใต้แสง UV ความยาวคลื่น 365 นาโนเมตร และเรืองแสงสีฟ้ามากขึ้นเมื่อพ่นด้วย 10% KOH และตรวจสอบภายใต้แสง UV ความยาวคลื่น 365 นาโนเมตร สารเปรียบเทียบ umbelliferone มีค่า hRf = 36 

ตัวอย่างที่ 4ตรวจสอบสารสกัดเมทานอลของใบทองพันชั่งด้วยเทคนิค TLC โดยสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (24)

TLC plate: ไม่ระบุ

Mobile phase: toluene : ethyl acetate (75 : 25)

Sample volume: 5มคล.

Spray reagent: vanillin-sulfuric acid

Reference standard: -

UV detector: UV ที่ความยาวคลื่น 254 นาโนเมตรและ UV ที่ความยาวคลื่น 366 นาโนเมตร

การวิเคราะห์ปริมาณสารสำคัญด้วยวิธี TLC

นำสารสกัดของใบทองพันชั่งขนาด 10 มคล. มา spot ลงบนแผ่น TLC นำมา develop ในระบบตัวทำละลาย chloroform : ethyl acetate (19.5 : 0.5) จากนั้นนำแผ่น TLC ที่ได้ไปตรวจวัดด้วยเครื่อง TLC densitometer คำนวณปริมาณสารสำคัญเทียบกับสารมาตรฐาน rhinacanthin-C (10)

การวิธีวิเคราะห์ปริมาณสารสำคัญด้วย High-performance liquid chromatography (HPLC)

นำสารสกัดที่ต้องการวิเคราะห์มาละลายในเมทานอล โดยสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (19)  

Column: TSK-gel ODS-80Ts (5มคม.;150 × 4.6 มม.), อุณหภูมิcolumn25 oC

Mobile phase: methanol : 5% aqueous acetic acid (80:20, v/v)

Flow rate: 1 มล./นาที

Injection volumes: 20 มคล.

Detector: photodiode array detector ที่ความยาวคลื่น 254 นาโนเมตร

การศึกษาเพื่อหาแนวทางสำหรับการจัดทำข้อกำหนดมาตรฐานของใบทองพันชั่ง

เนื่องจากในขณะนี้ยังไม่มีข้อกำหนดมาตรฐานของใบทองพันชั่งใน Thai Herbal Pharmacopoeia จึงได้รวบรวมการศึกษาที่เกี่ยวข้อง ซึ่งอาจใช้เป็นแนวทางในการกำหนดมาตรฐานเบื้องต้นของใบทองพันชั่งได้

ตัวอย่างการศึกษาที่ 1 ข้อกำหนดมาตรฐานของใบทองพันชั่ง (25)

ปริมาณผลรวม rhinacanthinsคำนวณในรูปของ rhinacanthin-C

ไม่น้อยกว่าร้อยละ 1.1 โดยน้ำหนัก

ปริมาณเถ้ารวม

ไม่เกินร้อยละ 17.9โดยน้ำหนัก

ปริมาณเถ้าที่ไม่ละลายในกรด 

ไม่เกินร้อยละ 1.1โดยน้ำหนัก

ปริมาณสารสกัดด้วยเอทานอล 

ไม่น้อยกว่าร้อยละ 2.2โดยน้ำหนัก

ปริมาณสารสกัดด้วยน้ำ 

ไม่น้อยกว่าร้อยละ 19.5 โดยน้ำหนัก

ตัวอย่างการศึกษาที่ 2 ข้อกำหนดของสารสกัดมาตรฐานของใบทองพันชั่งที่มีปริมาณ rhinacanthins สูง (11)

ปริมาณผลรวม rhinacanthins

ไม่น้อยกว่าร้อยละ 70.0 โดยน้ำหนัก 

ปริมาณความชื้น(loss on drying)

ไม่เกินร้อยละ 0.2 โดยน้ำหนัก 

ปริมาณเถ้ารวมของสารสกัด

ไม่เกินร้อยละ 2.3 โดยน้ำหนัก 

ปริมาณเถ้าที่ไม่ละลายในกรด 

ไม่มีเถ้าที่ไม่ละลายในกรด

การปนเปื้อนจุลชีพ

ไม่มีการปนเปื้อนโดยเชื้อแบคทีเรียและเชื้อรา

ตัวอย่างการศึกษาที่ 3 ข้อกำหนดมาตรฐานของทั้งต้นทองพันชั่ง (The requirement specification of R. nasutuscrude drug) (24)

ปริมาณสิ่งแปลกปลอม

ไม่เกินร้อยละ 1.0 โดยน้ำหนัก 

ปริมาณเถ้าที่ไม่ละลายในกรด 

ไม่เกินร้อยละ 7.0 โดยน้ำหนัก

ปริมาณเถ้ารวมของสารสกัด

ไม่เกินร้อยละ 12.0 โดยน้ำหนัก 

ปริมาณความชื้น (moisture content)

ไม่เกินร้อยละ 10.0 โดยน้ำหนัก 

การสูญเสียน้ำหนักจากการทำให้แห้ง (loss on drying)

ไม่เกินร้อยละ 11.0 โดยน้ำหนัก 

ปริมาณสารสกัดด้วยเอทานอล 

ไม่น้อยกว่าร้อยละ 1.0 โดยน้ำหนัก

ปริมาณสารสกัดด้วยน้ำ 

ไม่น้อยกว่าร้อยละ 15.0 โดยน้ำหนัก

ยังไม่มีการรายงานการศึกษาทางคลินิกสำหรับการใช้ประโยชน์ทางด้านเครื่องสำอางของทองพันชั่ง

1 การศึกษาเกี่ยวกับเส้นผมและหนังศีรษะ

1.1 ยับยั้งการหลุดร่วงของเส้นผม (H004)

การศึกษาฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ 5α-reductase ของสารสกัด 95% เอทานอลของทองพันชั่งจากจังหวัดเชียงใหม่ (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยใช้วิธีการแช่สกัด (maceration) ใน 95% เอทานอล นำสารสกัดที่ได้มาละลายใน 50% เอทานอล แล้วนำไปทดสอบฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ 5α-reductase ด้วยวิธี 5α-reductaseassay เปรียบเทียบผลกับยามาตรฐาน finasteride พบว่าสารสกัด 95% เอทานอลของทองพันชั่ง 1 ก. มีฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ 5α-reductase ได้เทียบเท่ากับยา finasteride ขนาด 10.69 มก. ซึ่งจัดว่ามีฤทธิ์อย่างอ่อนเมื่อเทียบกับสารสกัด 95% เอทานอลของสมุนไพรชนิดอื่น ๆ เช่น คำฝอย มะขามป้อม และตะไคร้ ซึ่งใน 1 ก. มีฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ 5α-reductase ได้เทียบเท่ากับยา finasteride ขนาด 24.30, 18.99, และ 18.55 มก. ตามลำดับ (26)

2 การศึกษาเกี่ยวกับผิวหน้า

2.1 ต้านสิวบนใบหน้า (F006)

การทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อก่อสิว (Propionibacterium acnes) ของสารสกัดเอทิลอะซิเตทและสารสกัดเมทานอลของทองพันชั่ง (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำผงแห้งของสมุนไพรมาแช่สกัดในตัวทำละลาย จากนั้นนำไปทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อ การทดสอบด้วยวิธี disc diffusion method พบว่าสารสกัดเอทิลอะซิเตทของทองพันชั่งแสดงค่า zone of inhibition เท่ากับ 10.3 มม. ในขณะที่สารสกัดเมทานอลของทองพันชั่งไม่แสดงฤทธิ์ การทดสอบด้วยวิธี broth dilution method พบว่าสารสกัดเอทิลอะซิเตทและสารสกัดเมทานอลของทองพันชั่งมีค่าความเข้มข้นที่ยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรียได้ (minimum inhibitory concentration; MIC) >5 มก./มล. จากผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า สารสกัดเอทิลอะซิเตทและสารสกัดเมทานอลของทองพันชั่งมีฤทธิ์ต้านเชื้อ P. Acnes เล็กน้อย (27)

การทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อก่อสิว (P. acnes) ของสารสกัดมาตรฐานใบทองพันชั่ง ซึ่งมีปริมาณของ rhinacanthins ทั้งหมดไม่น้อยกว่า 70 %w/w (rhinacanthin rich Rhinacanthus nasutus; RRn) และสาร rhinacanthin-C โดยเป็นใบทองพันชั่งจากจังหวัดนราธิวาส (voucher specimen: 001 18 14) นำมาสกัดด้วยวิธีแช่สกัดในเอทิลอะซิเตท  จากนั้นนำสารสกัดเอทิลอะซิเตทที่ได้มาผ่าน anion exchange columnได้เป็น RRn และนำไปวิเคราะห์ปริมาณสารสำคัญด้วยวิธี HPLC (19) ซึ่งพบว่ามีสาร rhinacanthin-C อยู่ในช่วง 12.6-201.0 มคก./มล. และมีสาร rhinacanthin-D และ rhinacanthin-N ประมาณ 3.1-51.0 มคก./มล.ทำการแยกสารบริสุทธิ์ด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟฟีและพิสูจน์โครงสร้างสารด้วยเทคนิค IR spectra, 1H และ 13C-NMR spectra จากนั้นนำ RRn และสาร rhinacanthin-C ไปทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อด้วยวิธี microdilution assay พบว่า RRn และ rhinacanthin-C มีค่า MIC เท่ากับ 16 และ 8 มคก./มล. ตามลำดับ ในขณะที่ยามาตรฐาน tetracycline มีค่า MIC เท่ากับ 0.5 มคก./มล.และมีค่าความเข้มข้นของยาที่สามารถฆ่าเชื้อแบคทีเรียได้ (minimum bactericidal concentration; MBC) เท่ากับ 32 และ >128 มคก./มล. ตามลำดับในขณะที่ยา tetracycline มีค่า MBC >32 มคก./มล. (12-13)

3 การศึกษาเกี่ยวกับผิวกาย

3.1 ทำให้ผิวขาว (S001)

การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ tyrosinase และ collagenase ของสารสกัดเอทานอลของใบทองพันชั่งจากจังหวัดระยอง (voucher specimen: A 015128 (BCU)) ซึ่งสกัดด้วยอุปกรณ์ soxhlet (ไม่ระบุระยะเวลา) และนำสารสกัดที่ได้มาระเหยตัวทำละลายออกโดยการลดความดันด้วยเครื่อง rotary evaporator เมื่อนำมาทดสอบกับ mushroom tyrosinase และ collagenase จาก Clostridium histolyticum พบว่า สารสกัดเอทานอลของใบทองพันชั่งขนาด 1 มก./มล. สามารถยับยั้งเอนไซม์ tyrosinase ได้ 64.68% (สารมาตรฐาน kojic acid ขนาด 0.1 มก./มล. สามารถยับยั้งเอนไซม์ tyrosinase ได้ 93.38%) และมีค่าความเข้มข้นที่สามารถยับยั้งได้ครึ่งหนึ่ง (IC50) เท่ากับ 271.5 มคก./มล. แต่สารสกัดดังกล่าวไม่มีฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ collagenase แสดงให้เห็นว่า สารสกัดเอทานอลของใบทองพันชั่งอาจมีฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ tyrosinase แต่ประสิทธิภาพยังน้อยกว่าสารมาตรฐาน kojic acid (28)

3.2 ต้านอนุมูลอิสระบนผิวกาย (S006)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดปิโตรเลียมอีเธอร์, สารสกัดเอทิลอะซิเตท และสารสกัดเมทานอลของใบทองพันชั่งจากจังหวัดบุรีรัมย์ (voucher specimen อยู่ใน NS06/00001–NS06/00009) โดยนำสมุนไพรมาล้าง ผึ่งให้แห้งในที่ร่มที่อุณหภูมิประมาณ 35-40 oC นานหลายวัน จากนั้นจึงบดให้ละเอียด นำไปสกัดด้วยปิโตรเลียมอีเธอร์, เอทิลอะซิเตท และเมทานอล ตามลำดับโดยจะสกัดด้วยตัวทำละลายชนิดเดียวกัน 3 ครั้งจึงเปลี่ยนเป็นตัวทำละลายชนิดถัดไป รวมสารสกัดที่ได้จากตัวทำละลายแต่ละชนิด และทำให้แห้งด้วยเครื่อง rotary evaporator ซึ่งจะได้สารสกัดปิโตรเลียมอีเธอร์, สารสกัดเอทิลอะซิเตท และสารสกัดเมทานอล การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วย 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) assay พบว่าสารสกัดปิโตรเลียมอีเธอร์, สารสกัดเอทิลอะซิเตท และสารสกัดเมทานอล มีค่า IC50 เท่ากับ >100, 19.34, และ 0.78 มคก./มล. ตามลำดับ ในขณะที่สารมาตรฐาน quercetin และ trolox มีค่า IC50เท่ากับ 0.17 และ 0.31 มคก./มล. ตามลำดับซึ่งจะเห็นว่า สารสกัดเมทานอลของใบทองพันชั่งมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ดี การวิเคราะห์ทางเคมีเพื่อหาปริมาณผลรวมสารฟีนอลิก (total phenolic content) โดยเทียบน้ำหนักของสารสกัดกับสาร caffeic acid พบว่าสารสกัดปิโตรเลียมอีเธอร์, สารสกัดเอทิลอะซิเตท และสารสกัดเมทานอลขนาด 3.72, 7.73, และ 8.45 มคก. ตามลำดับ มีปริมาณรวมของสารกลุ่มฟีนอลิกเทียบเท่ากับสาร caffeic acid 1 ไมโครโมล จึงคาดว่าสารออกฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระอาจเป็นสารกลุ่มฟีนอลิก (29)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดเอทานอลของทองพันชั่งจากจังหวัดเชียงราย (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำสมุนไพรแห้งมาเขย่ากับแอ็บโซลูท เอทานอล (absolute ethanol; ethyl alcohol 99.8%v/v) นาน 15 นาที กรอง แล้วนำไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay ร่วมกับ flow injection-spectrophotometric system โดยเปรียบเทียบกับ ascorbic acid พบว่าสารสกัดเอทานอลของทองพันชั่งมีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ(antioxidant capacity) เทียบเท่ากับ ascorbic acid (ascorbic acid equivalent; AAE) 0.019±0.001 มิลลิโมลาร์ (30)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดน้ำและสารสกัด 95% เอทานอลของใบทองพันชั่งจากร้านจำหน่ายผลิตภัณฑ์สมุนไพรในจังหวัดลำปาง (ไม่ระบุ specimen) โดยการนำสมุนไพรมาทำให้แห้งในตู้อบอุณหภูมิ 60 oC  นาน 72 ชม. บดให้ละเอียด สกัดด้วยตัวทำละลาย 2 ชนิด คือ น้ำกลั่น และ 95% เอทานอล โดยใช้อัตราส่วนของสมุนไพร:ตัวทำละลาย 1:10 w/v การสกัดด้วยน้ำ จะนำสมุนไพรไปแช่ในน้ำอุณหภูมิ 45 oC นาน 3 ชม. ส่วนการสกัดด้วย 95% เอทานอล จะนำสมุนไพรไปแช่สกัดใน 95% เอทานอลที่อุณหภูมิห้อง นาน 72 ชม. และหมั่นคนบ่อยๆ หลังจากครบเวลา นำสารสกัดที่ได้มากรอง และระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary evaporator โดยใช้อุณหภูมิ 45 oC และความดัน 50 mbar การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วย DPPH assay พบว่าสารสกัดน้ำและสารสกัด 95% เอทานอลของใบทองพันชั่งขนาด 1 ก. มีฤทธิ์ยับยั้งอนุมูลอิสระได้เทียบเท่ากับสารมาตรฐาน gallic acid ขนาด 9.09มก. และ16.53 มก. ตามลำดับ [gallic acid มีค่า IC50 เท่ากับ 0.005 มก./มล.] และการทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วย 2,2′– azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) radical anion scavenging assay พบว่าสารสกัดน้ำและสารสกัด 95% เอทานอลของใบทองพันชั่งขนาด 1 ก. มีฤทธิ์ยับยั้งอนุมูลอิสระได้เทียบเท่ากับสารมาตรฐาน trolox ขนาด 204.66 และ 41.83 มก. ตามลำดับ (trolox มีค่า IC50 ต่อ ABTS เท่ากับ 0.249 มก./มล.) แสดงให้เห็นว่าสารสกัดจากตัวทำละลายทั้ง 2 ชนิดของใบทองพันชั่งมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ โดยสารสกัดน้ำออกฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระได้ดีกว่าสารสกัด95% เอทานอล (31)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดปิโตรเลียมอีเธอร์, สารสกัดไดคลอโรมีเทน, และสารสกัดเอทานอลของใบทองพันชั่งจากจังหวัดระยอง [voucher specimen: A 015128 (BCU)] ซึ่งสกัดด้วยอุปกรณ์ soxhlet (ไม่ระบุระยะเวลา) และนำสารสกัดที่ได้มาระเหยตัวทำละลายออกโดยการลดความดันด้วยเครื่อง rotary evaporator การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วย DPPH assay พบว่า สารสกัดปิโตรเลียมอีเธอร์, สารสกัดไดคลอโรมีเทน, และสารสกัดเอทานอลขนาด 100 มคก./มล. สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ 7.38, 15.35, และ 29.63% ตามลำดับ ซึ่งสารสกัดแห้งขนาด 1 ก. ออกฤทธิ์ได้เทียบเท่ากับวิตามินซี (vitamin C equivalent antioxidant capacity) ขนาด 1.01, 2.32, และ 6.50 มก. ตามลำดับ และการทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วย ABTS scavenging activityassay พบว่า สารสกัดปิโตรเลียมอีเธอร์, สารสกัดไดคลอโรมีเทน, และสารสกัดเอทานอลขนาด 100 มคก./มล. สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ 13.55, 28.90, และ 56.26% ตามลำดับ ซึ่งสารสกัดแห้งขนาด 1 ก. ออกฤทธิ์ได้เทียบเท่ากับวิตามินซีขนาด 10.60, 28.29, และ 53.26 มก. ตามลำดับ แสดงให้เห็นว่าสารสกัดจากใบทองพันชั่งมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ โดยสารสกัดเอทานอลออกฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระได้ดีที่สุด (28)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดมาตรฐานของใบทองพันชั่ง (standardized rhinacanthins-rich extract; RRE) และสารสำคัญได้แก่ rhinacanthin-C, rhinacanthin-D, และ rhinacanthin-N ซึ่งแยกได้จาก RRE โดยใช้ใบทองพันชั่งจากจังหวัดสงขลา (voucher specimen: 0011814)  ทำการสกัดโดยนำใบทองพันชั่งมาอบให้แห้งด้วยตู้อบลมร้อน อุณหภูมิ 60 oC นาน 24 ชม. บดให้ละเอียดนำมาสกัดด้วยเอทานอล (ไม่อธิบายรายละเอียดของวิธีการสกัด) ซึ่งจะได้ RRE จากนั้นนำมาแยกสาร rhinacanthin-C, rhinacanthin-D, และ rhinacanthin-N โดยใช้ silica gel column และล้าง column (elute) ด้วยเฮกเซน : เอทิลอะซิเตท (99:1, v/v) ทำการวิเคราะห์ปริมาณสารสำคัญด้วย HPLC รวมทั้งพิสูจน์และเปรียบเทียบโครงสร้างสารด้วย 1H และ13C-NMR spectral data ซึ่งพบว่า RRE มี rhinacanthin-C, rhinacanthin-D, และ rhinacanthin-N เป็นส่วนประกอบ 62.2, 7.9, และ 3.6 %w/w ตามลำดับการทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ (superoxide scavenging activity) ด้วยเทคนิค cyclic voltammetry พบว่าRRE, rhinacanthin-C, rhinacanthin-D, และ rhinacanthin-N มีค่า IC50เท่ากับ 8.0, 9.6, 91.4, และ 45.1 มคก./มล. ตามลำดับ ซึ่งจะเห็นว่า RRE มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดีที่สุด รองลงมาคือ rhinacanthin-C แสดงให้เห็นว่า สารสกัดมาตรฐานของใบทองพันชั่งและสารสำคัญที่แยกได้ โดยเฉพาะ rhinacanthin-C มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ดี (14)

3.3 ต้านการอักเสบของผิวกาย (S014)

การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งสารก่อการอักเสบ nitric oxide (NO) และ tumor necrosis factor-α  (TNF-α) ของสารสกัด 50% เอทานอล และสารสกัดน้ำของใบทองพันชั่งจากจังหวัดเชียงใหม่ (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งสกัดโดยนำใบทองพันชั่งสดมาล้าง หั่นเป็นชิ้นเล็กๆ นำไปทำให้แห้ง บดให้ละเอียดนำมาสกัดด้วย 50% เอทานอล หรือน้ำกลั่น โดยการคนเป็นเวลานาน 4 ชม. นำสารสกัดเอทานอลที่ได้มากรอง ส่วนสารสกัดน้ำนำมาปั่นด้วยเครื่องหมุนเหวี่ยง (centrifuge) ด้วยความเร็ว 5,000 รอบ/นาทีนาน 10 นาที แล้วจึงนำไปกรอง นำสารสกัดที่ได้มาระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่องrotary evaporator ที่อุณหภูมิ 60 oC และทำให้แห้งด้วยความเย็น (lyophilize) นำมาทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้าง NO และ TNF-α  ในเซลล์ macrophage ชนิด J774.2 ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย lipopolysaccharide (LPS) ขนาด 100 นาโนกรัม/มล. โดยใช้สารสกัดขนาด 62.5, 125, 250, 500, และ 1,000 มคก./มล. พบว่าสารสกัดทั้ง 2 ชนิดของใบทองพันชั่งไม่สามารถยับยั้งการสร้าง NO ได้ โดยสารสกัดน้ำขนาด 1,000 มคก./มล. สามารถยับยั้งได้เพียงเล็กน้อย และสารสารสกัดทั้ง 2 ชนิดของใบทองพันชั่งทำให้การสร้าง TNF-α  ในเซลล์เพิ่มขึ้น การทดสอบผลต่อการแสดงออกของยีน inducible nitric oxide synthase (iNOS) และ TNF-α พบว่า สารสกัดทั้ง 2 ชนิดของใบทองพันชั่งเพิ่มการแสดงออกของยีน TNF-α แต่ไม่มีผลต่อ iNOS จากผลการทดลองคาดว่าสารสกัดของใบทองพันชั่งอาจกระตุ้นการอักเสบหรือกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกัน โดยออกฤทธิ์กระตุ้นการสร้าง NO และ TNF-α ของเซลล์ macrophage ซึ่งอาจเป็นกลไกในการออกฤทธิ์ต้านจุลชีพของใบทองพันชั่ง (32)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารrhinacanthin C, rhinacanthin-D, และ rhinacanthin-N ซึ่งแยกได้จากสารสกัดเอทิลอะซิเตทของใบทองพันชั่งจากจังหวัดนราธิวาส (voucher specimen: SKP0011814) โดยการนำผงแห้งของใบทองพันชั่งมาสกัดด้วยวิธีสกัดแบบไหลย้อนกลับ (reflux) ในเอทิลอะซิเตท นาน 1 ชม. นำสารสกัดที่ได้มาทำให้แห้ง และนำไปแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟฟี พิสูจน์โครงสร้างสารด้วยการเปรียบเทียบ 1H และ13C-NMR spectral dataจากนั้นนำไปทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการหลั่ง NO, prostaglandin E2 (PGE2) และ TNF-α ในเซลล์ macrophage ชนิด RAW264.7 ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย LPS ขนาด 200 มคก./มล.การทดสอบฤทธิ์ยับยั้ง NO พบว่า สาร rhinacanthin C, rhinacanthin-D, และ rhinacanthin-N มีค่า IC50เท่ากับ 1.8, 6.2, และ 3.0 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ ในขณะที่ยาต้านการอักเสบ indomethacin, สารมาตรฐานL-Nitroarginine (L-NA)*, และ caffeic acid-phenethylester (CAPE)* มีค่า IC50 ต่อ NO เท่ากับ 25.0, 61.8, และ 5.6 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ การทดสอบฤทธิ์ยับยั้ง PGE2พบว่า สาร rhinacanthin C, rhinacanthin-D, และ rhinacanthin-N มีค่า IC50 เท่ากับ 10.4, 14.4, และ 52.1 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ และการทดสอบฤทธิ์ยับยั้ง TNF-α พบว่า สารทั้ง 3 ชนิดมีค่า IC50 มากกว่า 100 ไมโครโมลาร์ ซึ่งจะเห็นว่าสาร rhinacanthin C ออกฤทธิ์ได้ดีที่สุด และออกฤทธิ์ได้ดีกว่ายา indomethacin, L-NA, และ CAPE เมื่อนำสาร rhinacanthin C ขนาด 10 และ 30 ไมโครโมลาร์ มาทดสอบผลต่อการแสดงออกของ iNOS และ cyclooxygenase-2 (COX-2)mRNA พบว่าสามารถยับยั้งการแสดงออกของ iNOS และ COX-2 ได้อย่างชัดเจน โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้แสดงให้เห็นว่าสารสำคัญจากใบทองพันชั่ง โดยเฉพาะสาร rhinacanthin C มีฤทธิ์ต้านการอักเสบที่ดี (15)

* L-Nitroarginine (L-NA) คือสารมาตรฐานซึ่งเป็น NOS inhibitor และ caffeic acid-phenethylester (CAPE)คือสารมาตรฐานเป็น nuclear factor-kappaB (NF-κB) inhibitor

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดปิโตรเลียมอีเธอร์, สารสกัดเอทิลอะซิเตท และสารสกัดเมทานอลของใบทองพันชั่งจากจังหวัดบุรีรัมย์ (voucher specimen อยู่ใน NS06/00001–NS06/00009) โดยนำสมุนไพรมาล้าง ผึ่งให้แห้งในที่ร่มที่อุณหภูมิประมาณ 35-40 องศาเซลเซียส นานหลายวัน จากนั้นจึงบดให้ละเอียด นำไปสกัดด้วยปิโตรเลียมอีเธอร์, เอทิลอะซิเตท และเมทานอล ตามลำดับโดยจะสกัดด้วยตัวทำละลายชนิดเดียวกัน 3 ครั้งจึงเปลี่ยนเป็นตัวทำละลายชนิดถัดไป รวมสารสกัดที่ได้จากตัวทำละลายแต่ละชนิด และทำให้แห้งด้วยเครื่อง rotary evaporator ซึ่งจะได้สารสกัดปิโตรเลียมอีเธอร์, สารสกัดเอทิลอะซิเตท และสารสกัดเมทานอล การทดสอบฤทธิ์ยับยั้ง nuclear factor-kappaB (NF-κB) ในเซลล์ HeLa และวิเคราะห์ผลด้วย luciferase assay พบว่าสารสกัดปิโตรเลียมอีเธอร์, สารสกัดเอทิลอะซิเตท และสารสกัดเมทานอล มีค่า IC50 เท่ากับ 138.16, 104.04, และ 118.03 มคก./มล. ตามลำดับ ในขณะที่สารมาตรฐาน parthenolide มีค่า IC50 เท่ากับ 1.97 มคก./มล. การทดสอบฤทธิ์ยับยั้ง PGE2, interleukin (IL)-6, IL-1β, และ TNF-α ในเซลล์ primary monocyte ซึ่งถูกเหนี่ยวนำด้วย LPS โดยใช้สารสกัดขนาด 1, 10, และ 50มคก./มล. พบว่า สารสกัดทั้ง 3 ชนิดทำให้การทำงานของ PGE2 เพิ่มขึ้น และค่า IC50สำหรับการยับยั้งIL-6, IL-1β, และ TNF-αของสารสกัดทั้ง 3 ชนิด คือมากกว่า 50 มคก./มล. ยกเว้นสารสกัดเอทิลอะซิเตท ที่มีค่า IC50ต่อ TNF-α เท่ากับ 43.83 มคก./มล. ในขณะที่ยามาตรฐานhydrocortisone มีค่า IC50 ต่อ PGE2,IL-6, IL-1β, และ TNF-αเท่ากับ 0.77, 0.32, 1.44, และ 0.89 มคก./มล. ตามลำดับ แสดงให้เห็นว่า สารสกัดปิโตรเลียมอีเธอร์สารสกัดเอทิลอะซิเตท และสารสกัดเมทานอลของใบทองพันชั่ง อาจมีฤทธิ์ยับยั้งสารก่อการอักเสบเล็กน้อย (29)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดมาตรฐานใบทองพันชั่ง (SRLE) (ไม่ระบุแหล่งที่มา,voucher specimen, และวิธีการสกัด) ซึ่งมีปริมาณของ rhinacanthins ทั้งหมดไม่น้อยกว่า 70 %w/w และสาร rhinacanthin-C ที่แยกได้ เมื่อนำไปทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบโดยใช้ carrageenan เหนี่ยวนำให้เกิดการบวมที่อุ้งเท้าหนูพบว่าการให้สาร SRLE และสารrhinacanthin-C ทางปากขนาด 80, 160 และ 320 มก./กก. สามารถยับยั้งการบวมที่อุ้งเท้าของหนูขาวใหญ่ได้ โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้แต่การทดสอบโดยใช้น้ำมันสลอดเหนี่ยวนำให้เกิดการบวมที่หูของหนูถีบจักร พบว่าการทาสาร SRLE และสารrhinacanthin-C ขนาด 1.0, 2.0 และ 4.0 มก./หู ไม่สามารถลดการบวมที่หูได้แสดงให้เห็นว่า สาร SRLE และ rhinacanthin-C อาจมีฤทธิ์ต้านการอักเสบเมื่อให้ทางปากแต่ไม่มีฤทธิ์ต้านการอักเสบเมื่อให้โดยการทา (16)

การทดสอบฤทธิ์บรรเทาปวดและฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดมาตรฐานของใบทองพันชั่งจากจังหวัดสงขลา (voucher specimen: 0011814) โดยนำใบทองพันชั่งสดมาอบแห้งที่อุณหภูมิ 50 oC นาน 24 ชม. นำมาบดให้เป็นผงละเอียด แช่สกัดใน 95% เอทิลอะซิเตทที่อุณหภูมิห้อง นาน 3 วัน และมีการคนบ่อยๆ นำมากรอง ระเหยตัวทำละลายจนได้สารสกัดลักษณะข้นเหนียวคล้ายน้ำเชื่อม (syrupy mass) นำสวนกากไปแช่สกัดด้วยเอทิลอะซิเตทอีก 4 ครั้ง นำมากรองและระเหยตัวทำละลายจนได้สารสกัดที่มีลักษณะเป็นก้อนเหนียว (thick viscous mass) นำสารสกัดที่ได้มาเตรียมสารสกัดมาตรฐานโดยละลายในเมทานอล กรอง และนำไปใส่ใน column ที่บรรจุ Amberlite® IRA-67 ปล่อยให้สารละลายไหลด้วยอัตราเร็ว 1.5 มล./นาที จากนั้นล้าง column ด้วยเมทานอลเพื่อกำจัด chlorophyllโดยที่สาร rhinacanthins จะยังอยู่ใน column จากนั้นล้าง column ด้วย 10% กรดอะซิตริกในเมทานอล ซึ่งจะได้สารสกัดที่อุดมไปด้วยสาร rhinacanthins ออกมา นำไประเหยตัวทำละลายออกโดยการลดความดัน ทำการวิเคราะห์ปริมาณและแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟฟี และพิสูจน์โครงสร้างสารด้วยการเปรียบเทียบ 1H-NMR spectral data ซึ่งพบว่าสารสกัดมาตรฐานมีสาร rhinacanthin-C เป็นส่วนประกอบอยู่ไม่น้อยกว่า 70%w/w นำสารสกัดมาตรฐานและสาร rhinacanthin-C ที่แยกได้มาทดสอบฤทธิ์บรรเทาปวดในหนูแรท โดยป้อนสารทดสอบให้หนูในขนาด 20, 40 และ 80 มก./กก. หรือยามาตรฐาน indomethacin 5 มก/กก. หรือได้รับ morphine sulfate 5 มก/กก. (ฉีดเข้าใต้ผิวหนัง) พบว่าทั้งสารสกัดมาตรฐานและสาร rhinacanthin-C มีฤทธิ์บรรเทาปวดใน acetic acid-induced writhing test และ formalin test โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้ แต่ไม่ได้ผลใน hot plate test และมีประสิทธิภาพใกล้เคียงกับยา indomethacin แต่ยังน้อยกว่า morphine การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบโดยเหนี่ยวนำให้เกิดการบวมด้วยการฉีดสาร carrageenan และการฝังก้อนสำลีในหนูแรท โดยป้อนสารทดสอบให้หนูในขนาด 80, 160 และ 320 มก./กก. หรือยา indomethacin 5 มก/กก. พบว่าทั้งสารสกัดมาตรฐานและสาร rhinacanthin-C มีฤทธิ์ต้านการอักเสบ โดยสามารถยับยั้งการบวมจากการเหนี่ยวนำด้วยสาร carrageenan และยับยั้งการสร้าง granuloma จากการเหนี่ยวนำด้วยการฝังก้อนสำลีได้ โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้ ซึ่งทั้งสารสกัดมาตรฐานและสาร rhinacanthin-C มีประสิทธิภาพที่ใกล้เคียงกัน และมีประสิทธิภาพน้อยว่ายา indomethacin เพียงเล็กน้อย แสดงให้เห็นว่าสารสกัดมาตรฐานจากใบทองพันชั่ง และสาร rhinacanthin-C มีฤทธิ์บรรเทาปวดและต้านการอักเสบเมื่อทำการทดสอบในสัตว์ทดลอง (17)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดเอทานอลของใบทองพันชั่งจากประเทศอินเดีย (voucher specimen: (PCOP/Ph’cog/ 15/06/2014) โดยนำใบทองพันชั่งมาทำให้แห้งที่อุณหภูมิ 35-40oC นานหลายวัน นำมาบดให้เป็นผงหยาบๆ สกัดด้วยเอทานอล โดยการให้ความร้อนอย่างต่อเนื่อง (hot continuous extraction method) นาน 6 ชม. จากนั้นปล่อยให้เย็นที่อุณหภูมิห้อง และทำให้แห้งด้วยเครื่อง rotatory evaporator นำไปทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบในหนูแรทที่ถูกเหนี่ยวนำให้อุ้งเท้าบวมด้วย carrageenan โดยป้อนหนูด้วยสารสกัดขนาด 1 ก./กก. หรือยามาตรฐาน indomethacinขนาด 10 มก./กก. หลังจากนั้น 1 ชม. จึงฉีด 1% carrageenan ขนาด 0.5 มล. เข้าบริเวณอุ้งเท้าหลังข้างซ้ายของหนู ทำการวิเคราะห์ขนาดอุ้งเท้าก่อนการฉีด carrageenan และหลังการฉีด carrageenan ที่เวลา 30 นาที, 1, 2, 3, และ 4 ชม. ด้วย plethysmometer พบว่าสารสกัดเอทานอลของใบทองพันชั่งสามารถลดการบวมได้อย่างชัดเจนในชั่วโมงที่ 4 ซึ่งสามารถลดการบวมได้ 61% ในขณะที่ยามาตรฐาน indomethacin สามารถลดการบวมได้ 70% แสดงให้เห็นว่า สารสกัดเอทานอลของใบทองพันชั่งมีฤทธิ์ต้านการอักเสบจากการเหนี่ยวนำด้วย carrageenan (33)

3.4 ต้านการแพ้ของผิวกาย (S016)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการแพ้ของสารสำคัญที่แยกได้จากสารสกัดเอทิลอะซิเตทของทองพันชั่งจากจังหวัดนราธิวาส (voucher specimen: SKP0011814) โดยนำผงแห้งของใบทองพันชั่งมาสกัดด้วยวิธีสกัดแบบไหลย้อนกลับในเอทิลอะซิเตท นาน 1 ชม. จากนั้นนำมาทำให้แห้ง นำสารสกัดที่ได้มาแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟฟี และพิสูจน์โครงสร้างสารด้วยการเปรียบเทียบ 1H และ13C-NMR spectral data ซึ่งจะได้สารอนุพันธ์ naphthoquinones จำนวน 3 ชนิด คือ rhinacanthin C, rhinacanthin-D, และ rhinacanthin-N นำมาทดสอบฤทธิ์ต้านการแพ้ด้วยวิธี anti-allergic activity assay โดยศึกษาฤทธิ์ยับยั้งการหลั่ง β-hexosaminidase จากเซลล์ RBL-2HE3 พบว่าสารทั้ง 3 ชนิด มีค่า IC50 เท่ากับ 6.9, 8.9, และ 6.4 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ โดยออกฤทธิ์ได้ดีกว่ายาต้านการแพ้มาตรฐาน ketotifen fumarate ซึ่งมีค่า IC50 เท่ากับ 47.5 ไมโครโมลาร์ การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการหลั่ง TNF-α และ IL-4 ของเซลล์ RBL-2HE3 จากการเหนี่ยวนำด้วยสารก่อภูมิแพ้ anti-dinitrophenyl immunoglobulin E (anti-DNP-IgE) พบว่า rhinacanthin C, rhinacanthin-D, และ rhinacanthin-N สามารถยับยั้งการหลั่ง TNF-αได้ดี โดยมีค่า IC50 เท่ากับ 0.7, 3.8, และ 10.3 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ ในขณะที่ยาต้านการแพ้มาตรฐาน cromolyn sodium มีค่า IC50 เท่ากับ 14.1 ไมโครโมลาร์ และ rhinacanthin C, rhinacanthin-D, และ rhinacanthin-N สามารถยับยั้งการหลั่ง IL-4 โดยมีค่า IC50 เท่ากับ 7.0, 5.4, และ 12.0 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ ในขณะที่ยา cromolyn sodium มีค่า IC50 เท่ากับ11.2 ไมโครโมลาร์ แสดงให้เห็นว่าสารสำคัญจากใบทองพันชั่งมีฤทธิ์ต้านการแพ้ โดยคาดว่ากลไกการออกฤทธิ์อาจเกี่ยวข้องกับการยับยั้งการเกิด degranulation ของเซลล์ และยับยั้งการหลั่ง TNF-α และ IL-4  (18)

การทดสอบความเป็นพิษ

การศึกษาความเป็นพิษของใบทองพันชั่งจากประเทศเวียดนาม (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยป้อนใบทองพันชั่งให้หนูเม้าส์ในขนาด 0.5-1 ก./นน.ตัว 1 กก. (เทียบเท่ากับการรับประทานใบทองพันชั่ง 25-50 ก. หรือ 1 กำมือในคน) พบว่าไม่ทำให้สัตว์ทดลองเกิดอาการพิษ (34)

การศึกษาความเป็นพิษเฉียบพลันของสารสกัด 50% เอทานอลของทองพันชั่งทั้งต้น (ไม่ระบุแหล่งที่มา,voucher specimen และวิธีสกัด) ในหนูถีบจักรพันธุ์ YDT โดยการป้อนให้กินหรือฉีดเข้าใต้ผิวหนังในขนาด 10 ก./นน.ตัว 1 กก. (เทียบเป็น 3,333 เท่าของขนาดที่ใช้ในตำรายาเพื่อรักษาคน) พบว่าที่ขนาดดังกล่าวไม่ทำให้เกิดพิษ (35)

การทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลันของสารสกัดเอทานอลของใบทองพันชั่งจากประเทศอินเดีย (voucher specimen: (PCOP/Ph’cog/ 15/06/2014) โดยนำใบทองพันชั่งมาทำให้แห้งที่อุณหภูมิ 35-40oC นานหลายวัน นำมาบดให้เป็นผงหยาบๆ สกัดด้วยเอทานอล โดยการให้ความร้อนอย่างต่อเนื่อง (hot continuous extraction method) นาน 6 ชม. จากนั้นปล่อยให้เย็นที่อุณหภูมิห้อง และทำให้แห้งด้วยเครื่อง rotatory evaporator นำไปทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลันในหนูแรท ตามวิธีของ Organisation for Economic Cooperation and Development (OECD) guidelines (36) พบว่าการป้อนสารสกัดดังกล่าวให้หนูในขนาด 2,000 มก./กก. ไม่ทำให้เกิดความเป็นพิษ (33)

การทดสอบความเป็นพิษของสารสกัดมาตรฐานใบทองพันชั่ง (SRLE) (ไม่ระบุแหล่งที่มา, voucher specimen, และวิธีการสกัด) ซึ่งมีปริมาณของ rhinacanthins ทั้งหมดไม่น้อยกว่า 70%w/w พบว่ามีค่าประมาณค่าความเข้มข้นที่ทำให้สัตว์ทดลองตายครึ่งหนึ่ง (LD50) ของสาร SRLE คือ 2,000 มก./กก. เมื่อให้ทางปากในหนูถีบจักร (16)

การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารสกัด 50% เอทานอล และสารสกัดน้ำของใบทองพันชั่งจากจังหวัดเชียงใหม่ (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งสกัดโดยนำใบทองพันชั่งสดล้าง หั่นเป็นชิ้นเล็กๆ นำไปทำให้แห้ง บดให้ละเอียด นำมาสกัดด้วย 50% เอทานอล หรือน้ำกลั่น โดยการคนเป็นเวลานาน 4 ชม. นำสกัดเอทานอลที่ได้มากรอง ส่วนสารสกัดน้ำนำมาปั่นด้วยเครื่องหมุนเหวี่ยง (centrifuge) ด้วยความเร็ว 5,000 รอบ/นาที นาน 10 นาที แล้วจึงนำไปกรอง นำสารสกัดที่ได้มาระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary evaporator ที่อุณหภูมิ 60 oC และทำให้แห้งด้วยความเย็น (lyophilize) นำมาทดสอบกับเซลล์ macrophage ชนิด J774.2 ด้วย MTT assay พบว่าสารสกัดที่ขนาด 62.5 และ 1,000 มคก./มล. ไม่ก่อให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ (32)

ยังไม่มีรายงานข้อห้ามใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง

ยังไม่มีรายงานข้อควรระวังการใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง

ยังไม่มีรายงานอาการไม่พึงประสงค์จากการใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง

ไม่มีข้อมูล เนื่องจากยังไม่มีรายงานการศึกษาในคน มีแต่การศึกษาในหลอดทดลองหรือสัตว์ทดลอง

https://docs.google.com/spreadsheets/d/1CX21oFpTTNtb6TeS58hcWlSui0GWP6ZDFohYAS3PDHs/edit?usp=sharing