1 สาร brazilin : วิธีที่ใช้ในการวิเคราะห์คือhigh-performance liquid chromatography (HPLC) ตัวอย่างการศึกษามีดังนี้

การศึกษาที่1 สภาวะการทดลองที่ใช้ในการวิเคราะห์ (18) คือ 

column : Halo C18 (5µm, 4.6x150 มม.) อุณหภูมิคอลมน์ 35๐C

mobile phase : ระบบ gradient ระหว่างตัวทำละลาย A (เมทานอล) และB (2.5% acetic acid) เริ่มที่ความเข้มข้นของ A เท่ากับ 10% และความเข้มข้นของ B เท่ากับ 90% นาน 12 นาที, ปรับเพิ่มความเข้มข้นของ A เท่ากับ 100% นาน13นาที,จากนั้นลดอัตราส่วนลงให้เท่ากับเริ่มต้น นาน 15 นาที

flowrate : 1.0มล./นาที

injection volume : 20 มคล.

detector : photodiode array detector (SPD-M20A)ที่ความยาวคลื่น280นาโนเมตร

การศึกษาที่2 สภาวะการทดลองที่ใช้ในการวิเคราะห์ (13) คือ 

column : Intersil ODS-3 column (5µm, 6x250 มม.) อุณหภูมิคอลัมน์ 25๐C

mobile phase : เมทานอล และ 2.5% acetic acid (30:70 v/v)

flowrate : 1.0มล./นาที

injection volume : 20 มคล.

detector : photodiode array detector (Water 2707) ที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร

การศึกษาที่3 สภาวะการทดลองที่ใช้ในการวิเคราะห์ (19) คือ 

column : X-bridge C18 column (4.6x250มม.)

mobile phase : เมทานอลและ0.3% acetic acid (25:75 v/v)

flowrate : 1.0มล./นาที

injection volume : ไม่ระบุ

detector : UV detector ที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร

การศึกษาที่4 สภาวะการทดลองที่ใช้ในการวิเคราะห์ (7) คือ 

column : Kinetex C18 column (5 µm, 4.6x150 มม.)

mobile phase : water-acetonitrile 95:5, 0.1% trifluoroacetic acid, TFA in water (A) และ acetronitrile, 0.1% TFA (B) อัตราส่วนความเข้มข้นปรับเปลี่ยนตามเวลาที่กำหนด โดยความเข้มข้นของ A คือ 100% ที่เวลา 0-5 นาที, ความเข้มข้นของ B คือ 0-17.5% ที่เวลา 5-30 นาที, ความเข้มข้นของ B คือ 17.5-50% ที่เวลา 30-33 นาที,ความเข้มข้นของ B คือ 50-100% ที่เวลา 33-34 นาที,ความเข้มข้นของ B คือ 100% ที่เวลา 34-35 นาทีและความเข้มข้นของ A คือ 100% ที่เวลา 36-38 นาที 

flowrate : 0.5มล./นาที

injection volume : ไม่ระบุ

detector : photodiode array detector PDA-100ที่ความยาวคลื่น280 นาโนเมตร

การศึกษาที่5 สภาวะการทดลองที่ใช้ในการวิเคราะห์ (20) คือ 

column : ZORBAX Eclipse XDB-C18 column (5 µm, 250x4.6 มม.) with analytical guard column (5 µm, 12.5x4.6 มม.) อุณหภูมิ 25๐C

mobile phase : 0.3% acetic acid (A) และ acetronitrile (B) อัตราส่วนความเข้มข้นปรับเปลี่ยนตามเวลาที่กำหนดโดย ความเข้มข้นของ A คือ 85.5% B คือ 14.5% ที่เวลา 0-12 นาที, ความเข้มข้นของ A คือ 5% B คือ 95% ที่เวลา 15-18 นาที, ความเข้มข้นของ A คือ 85.5% B คือ 14.5% ที่เวลา 19-25 นาที 

flowrate : 1 มล./นาที

injection volume : 10 มคล.

detector : photodiode array detector ที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร

2 สาร episappanol, protosappanin C, (iso-)protosappanin B และsappanol : วิธีที่ใช้ในการวิเคราะห์คือ HPLC สภาวะการทดลองที่ใช้ในการวิเคราะห์ (7) คือ

column : Kinetex C18 column (5 µm, 4.6x150 มม.)

mobile phase : water-acetonitrile 95:5, 0.1% trifluoroacetic acid, TFA in water (A) และacetonitrile, 0.1% TFA (B) อัตราส่วนความเข้มข้นปรับเปลี่ยนตามเวลาที่กำหนดโดย ความเข้มข้นของ A คือ 100% ที่เวลา 0-5 นาที, ความเข้มข้นของ B คือ 0-17.5% ที่เวลา 5-30 นาที, ความเข้มข้นของ B คือ 17.5-50% ที่เวลา 30-33 นาที, ความเข้มข้นของ B คือ 50-100% ที่เวลา 33-34 นาที, ความเข้มข้นของ B คือ 100% ที่เวลา 34-35 นาที และ ความเข้มข้นของ A คือ 100% ที่เวลา 36-38 นาที 

flowrate : 0.5มล./นาที

injection volume : ไม่ระบุ

detector : photodiode array detector PDA-100 ที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร

ยังไม่มีรายงานการศึกษาทางคลินิกสำหรับการใช้ประโยชน์ทางด้านเครื่องสำอางของฝาง

นำผงแก่นฝางมาสกัดด้วยวิธีการสกัดแบบไหลย้อนกลับ (reflux) โดยใช้เอทานอล 95% เป็นตัวทำละลายจะได้สารสกัดที่มีสีน้ำตาลเข้ม นำไปทำให้เข้มข้นด้วยการระเหยแอลกอฮอล์ภายใต้สภาวะความดันต่ำ จะได้สารสกัดเอทานอลแก่นฝางที่เป็นสารสกัดหยาบ (CSE) นำสารสกัดหยาบที่ได้ไปแยกสกัดในซิลิกาเจลคอลัมน์ (silica gel column) และชะด้วยสารละลายเฮกเซนกับเอทิลอะซิเตท (อัตราส่วน 6:4) จะได้ส่วนสกัด 13 ส่วน นำส่วนสกัดที่ 5 และ 6 มารวมกัน แล้วนำไปแยกสกัดต่อในคอลัมน์ Sephadex LH-20 และชะด้วยเมทานอล จะได้ส่วนสกัดย่อย 7 ชนิด (A-G) นำส่วนสกัดย่อย E มาสกัดแยกซ้ำอีกครั้งในซิลิกาเจลคอลัมน์และชะด้วยสารละลายเฮกเซนกับเอทิลอะซิเตท (อัตราส่วน 6:4) จะได้ส่วนสกัด CS-1 ที่มีลักษณะใสเหมือนผลึกแก้ว สีแดง นำส่วนสกัด CS-1 มาวิเคราะห์ด้วยเครื่อง NMR Spectroscopy พบว่าเป็นสาร brazilin นอกจากนี้ ได้มีการนำสารสกัด CSE มาทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธีที่ง่ายขึ้น โดยนำ CSE มาละลายในเอทานอล 35% กรองเอาส่วนใสมาสกัดแยกในคอลัมน์ Diaion HP-20 และชะด้วยเอทานอล 35% ทิ้งส่วนสกัดที่แยกได้ในช่วงแรก (2 ลิตร) และเก็บส่วนสกัดที่เหลือ (4 ลิตร) ทำเช่นนี้ 3 ครั้ง นำส่วนสกัดที่ได้ไปทำให้เข้มข้นด้วยการระเหยแอลกอฮอล์จะได้สารสกัดที่มีสีค่อนข้างแดง (BRE) นำสารที่สกัดได้ทั้ง 3 ชนิด (CSE, BRE และ brazilin) ไปทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียที่ก่อให้เกิดสิว 3 ชนิด ได้แก่ Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus และ S. edidermidis ด้วยวิธี broth microdilution assay พบว่า สาร brazilin มีฤทธิ์ในการยับยั้งเชื้อแบคทีเรียได้ดีที่สุด [ค่า minimum inhibitory concentration (MIC) ต่อเชื้อ P. acnes, S. aureus และ S. edidermidis เท่ากับ 15.6, 31.2 และ 62.5 มคก./มล. ตามลำดับ และค่า minimum bactericidal concentration (MBC) เท่ากับ 31.2, 62.5 และ 62.5 มคก./มล. ตามลำดับ] รองลงมาคือ BRE (ค่า MIC ต่อเชื้อ P. acnes, S. aureus และ S. edidermidis เท่ากับ 31.2, 62.5 และ 125 มคก./มล. ตามลำดับ และค่า MBC เท่ากับ 62.5, 125 และ 125 มคก./มล. ตามลำดับ) และ CSE (ค่า MIC ต่อเชื้อ P. acnes, S. aureus และ S. edidermidis เท่ากับ 62.5, 125 และ 250 มคก./มล. ตามลำดับ และค่า MBC เท่ากับ 125, 250 และ 250 มคก./มล. ตามลำดับ) แสดงให้เห็นว่า brazilin คือ สารออกฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียในแก่นฝาง ซึ่งในการศึกษาวิจัยนี้ได้เสนอแนวทางการสกัดสารจากแก่นฝางและการทำให้สารสกัดบริสุทธิ์ด้วยวิธีที่ง่ายขึ้นด้วยการใช้ macropopous resin column และชะด้วยเอทานอล 35% สารที่ได้ (BRE) เมื่อนำมาวิเคราะห์ด้วย HPLC พบว่า สามารถเพิ่มปริมาณสาร brazilin ขึ้นได้ 39.9% และเพิ่มประสิทธิผลในการยับยั้งเชื้อแบคทีเรียเมื่อเทียบกับสารสกัดหยาบ (CSE) แม้ว่าผลที่ได้ไม่ดีเท่าสาร brazilin บริสุทธิ์ แต่ก็อาจเป็นทางเลือกหนึ่งในการใช้เพื่อลดต้นทุนในการพัฒนาผลิตภัณฑ์เครื่องสำอาง (13)

ศึกษาฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียของสารสกัดแก่นฝางที่ประกอบด้วยสาร brazilin (BRE) และสาร brazilin โดยนำตัวอย่างแก่นฝางจากร้านสามัคคีโอสถ จังหวัดชลบุรี ประเทศไทย มาล้างทำความสะอาด และอบให้แห้งที่อุณหภูมิ 60 ๐C นาน 24 ชม. ด้วยเครื่องอบลมร้อนและบดเป็นผงละเอียด นำผงแก่นฝางมาสกัดด้วยวิธีการสกัดแบบไหลย้อนกลับโดยใช้เอทานอล 95% เป็นตัวทำละลายนาน 1 ชม. จะได้สารสกัดที่มีสีน้ำตาลเข้ม นำไปทำให้เข้มข้นด้วยการระเหยแอลกอฮอล์ภายใต้สภาวะความดันต่ำ นำสารสกัดหยาบที่ได้ไปแยกสกัดในซิลิกาเจลคอลัมน์ และ Sephadex LH-20column จะได้สาร brazilin ที่มีลักษณะใสเหมือนผลึกแก้ว สีแดงส่วนการสกัดสาร BRE ทำได้โดย นำสารสกัดหยาบมาละลายในเอทานอล 35% กรองเอาส่วนใสมาสกัดแยกในคอลัมน์ Diaion HP-20 (สารสกัดหยาบ 1 ก./เรซิน 60 ก.) และชะด้วยเอทานอล 35% ทิ้งส่วนสกัดที่แยกได้ในช่วงแรก (3 ลิตร) และเก็บส่วนสกัดที่เหลือ (6 ลิตร) นำส่วนสกัดที่ได้ไปทำให้เข้มข้นด้วยการระเหยแอลกอฮอล์จะได้สารสกัด BRE ที่มีสีค่อนข้างแดงและมีสาร brazilin เป็นส่วนประกอบไม่ต่ำกว่า 40% เมื่อนำสารสกัด BRE และ brazilin ไปทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย S. aureus และ Pseudomonas aeruginosaพบว่า ค่า MIC และ MBC ของสาร brazilin ต่อเชื้อ S. aureus และ P. aeruginosaมีค่าเท่ากับ 63 และ 125 มคก./มล. ตามลำดับ ส่วนสารสกัด BRE มีค่า MIC และ MBC ต่อเชื้อ S. aureusและ P. aeruginosaเท่ากับ 125 และ 250 มคก./มล. ตามลำดับในขณะที่สารเปรียบเทียบ ampicillin มีค่า MIC และ MBC ต่อเชื้อ S. aureus และ P. aeruginosa เท่ากับ 0.1 และ 0.5 มคก./มล. ตามลำดับ (17)

ศึกษาฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียก่อสิว P. acnes ของสารสกัดจากแก่นฝาง โดยซื้อตัวอย่างจากตลาดในเมือง Semarang ประเทศอินโดนีเซีย (specimen no. 06001) นำแก่นฝางมาอบให้แห้งและบดเป็นผงก่อนนำมาแช่สกัดในเมทานอล นาน 12 ชม. 2 ครั้ง กรองสารสกัดด้วยกระดาษกรอง (Whatman no. 2) และทำให้เข้มข้นโดยการระเหยแอลกอฮอล์ที่อุณหภูมิ 30๐C ด้วยเครื่องระเหยสารภายใต้สุญญากาศ (rotary evaporator) นำสารสกัดหยาบที่ได้ไปแยกสกัดในซิลิกาเจลคอลัมน์และชะด้วยสารละลายเฮกเซน เอทิลอะซิเตท และเมทานอล จะได้ส่วนสกัด 30 ส่วน ส่วนสกัดที่ได้จากการชะด้วยเอทิลอะซิเตทจะให้สารที่ประกอบด้วย brazilin (ส่วนสกัดที่ 4)protosappanin A (ส่วนสกัดที่ 5) sappanoneB (ส่วนสกัดที่ 6-8) และสารประกอบอื่นๆ นำมาทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี preparative HPLC [Inertsil ODS-3 column (21.5 x 300 มม.), mobile phase:  ระบบ gradient ของสารละลายคือเมทานอลใน 0.5% trifluoroacetic acid เข้มข้น 5%-100% นาน 45 นาที, flow rate: 10 มล./นาที] สำหรับสาร brazilin ให้ทำ preparative HPLC ซ้ำอีกครั้ง เพื่อให้ได้สารที่บริสุทธิ์มากขึ้น นำสารที่สกัดได้ทั้ง 3 ชนิดไปทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียก่อสิว P.acnesและฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ lipaseซึ่งเป็นเอนไซม์ที่เชื้อ P. acnesผลิตขึ้นมาเพื่อย่อยสลายไตรกลีเซอไรด์ในชั้นผิวหนังให้เป็นกรดไขมันอิสระก่อให้เกิดอาการระคายเคืองและการอักเสบ พบว่า สาร brazilin มีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อ P.acnesได้ดีที่สุด โดยมีค่า MIC และ MBC เท่ากับ 0.5 มก./มล. ในขณะที่สาร protosappanin A และ sappanone B มีค่า MIC และ MBC เท่ากับ 1.0 มก./มล.[สารเปรียบเทียบ tetracycline, chloramphenicol และ 3-methyl-4-isopropylphenol (IPMP) มีค่า MIC และ MBC เท่ากับ 0.03, 0.13 และ 1.0 มก./มล.ตามลำดับ] เช่นเดียวกับผลการยับยั้งเอนไซม์ lipaseที่สาร brazilin มีค่าความเข้มข้นในการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ลงครึ่งหนึ่ง (IC50) เท่ากับ 6 ไมโครโมลาร์ ในขณะที่สาร protosappanin A และ sappanone B มีค่าเท่ากับ 100 และ >1,650 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ(สารเปรียบเทียบ tetracycline, chloramphenicol และ IPMP มีค่าเท่ากับ 1,060, 677 และ 1,109 มก./มล.ตามลำดับ)แสดงให้เห็นว่าสารสำคัญจากแก่นฝางที่มีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียก่อสิว P. acnesได้ดีที่สุดคือ brazilin (14)

ศึกษาฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียก่อสิว P. acnes และ S. edidermidis ของสารสกัดเมทานอลจากแก่นฝาง (ตัวอย่างจากประเทศอินเดีย) โดยนำแก่นฝางมาล้างทำความสะอาด อบให้แห้งและบดเป็นผงแล้วนำมาสกัดด้วยเครื่อง Soxhlet โดยใช้เมทานอลเป็นตัวทำละลาย ที่อุณหภูมิ 64.7๐C นาน 24 ชม. นำสารสกัดที่ได้มาทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย P. acnes และ S. edidermidis ด้วยวิธี disc diffusion method พบว่า สารสกัดเมทานอลแก่นฝางมีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อแบคทีเรียก่อสิว P. acnes และ S. edidermidis โดยมีค่า zone of inhibition เท่ากับ 19 และ 20 มม. ตามลำดับ ในขณะที่สารเปรียบเทียบ clindamycin มีค่าเท่ากับ 16 มม. (21)

1.2 เครื่องสำอางตกแต่งใบหน้า (F009)

การพัฒนาผลิตภัณฑ์เครื่องสำอางสำหรับใช้ปัดและตกแต่งบริเวณแก้มหรือบลัชออน (blush on)จากแก่นฝาง โดยนำตัวอย่างผงแก่นฝาง (ไม่ระบุที่มาของตัวอย่าง) มาแช่สกัดในเมทานอล 96% ในอ่างควบคุมอุณหภูมิ (water bath) โดยรักษาอุณหภูมิไว้ที่ 80๐C คนเบาๆ นาน 48 ชม. ในระหว่างการสกัดทำการวัดค่าความเป็นกรด-ด่าง และปรับให้เป็นกลาง (ค่า pH เท่ากับ 7) ด้วย citric acid หรือ sodium bicarbonate และพยายามหลีกเลี่ยงไม่ให้สารสกัดโดนแสงแดด จากนั้นกรองเอาสารละลายมาทำให้แห้งและเข้มข้นด้วยการระเหยแอลกอฮอล์ที่อุณหภูมิ 80๐C นำสารสกัดที่ได้มาตั้งตำรับสำหรับทำบลัชออนที่มีสารสกัดแก่นฝางเข้มข้น 5, 10 และ 20%(ส่วนผสมอื่นในตำรับใช้เหมือนกันคือ talcum, kaolin, paraffin liquid, zinc oxide และ isopropyl myristate) จากการทดสอบคุณสมบัติทางกายภาพของบลัชออนที่ได้พบว่า ผลิตภัณฑ์ทั้ง 3 สูตร (สารสกัดแก่นฝางเข้มข้น 5, 10 และ 20%) มีลักษณะเป็นสีชมพูอ่อน มีค่าpH เท่ากับ 7 สามารถยึดเกาะผิวหนังได้ดี แต่สีของผลิตภัณฑ์ไม่คงทน โดยสีจะเริ่มจางลงในวันที่ 5 เมื่อเก็บที่อุณหภูมิห้อง (22)

2 การศึกษาเกี่ยวกับผิวกาย

2.1 ทำให้ผิวขาว (ยับยั้งการสร้างเม็ดสีและเอนไซม์ไทโรซิเนส) (S001)

ศึกษาฤทธิ์ยับยั้งการสร้างเม็ดสีเมลานิน (melanin) ของสาร sappanone A ซึ่งสกัดได้จากผงแก่นฝาง (ไม่ระบุที่มาของตัวอย่าง) นำมาแช่สกัดในเอทานอล 95% ที่อุณหภูมิห้อง และทำให้สารสกัดเข้มข้นด้วยการระเหยสารละลายแอลกอฮอล์ นำสารสกัดหยาบที่ได้ไป partition ด้วยน้ำและเอทิลอะซิเตทแยกชั้นของเอทิลอะซิเตท จากนั้นระเหยตัวทำละลายให้แห้ง นำสารสกัดส่วนที่เหลือละลายในสารละลายเมทานอล:น้ำ (9.5:0.5) แล้วนำไป partition กับเอ็น-เฮกเซน (1:1) นำชั้นของสารละลายเมทานอลไปแยกต่อโดยใช้ silica gel column chromatography ชะด้วยสารละลายเอ็น-เฮกเซน:เอทิลอะซิเตท (7.5:2.5, 1:1, 2.5:7.5), เอทิลอะซิเตท, เอทิลอะซิเตท:เมทานอล (1:1) และเมทานอล เก็บส่วนสกัดที่ได้มาตรวจด้วยวิธี Thin Layer Chromatography (TLC) จะพบส่วนสกัด 8 ส่วน นำส่วนสกัดที่ 3 มาทำให้บริสุทธิ์ด้วยการผ่านคอลัมน์ Sephadex LH-20 และชะด้วยเมทานอล จะได้สาร sappanone A ซึ่งสามารถวิเคราะห์โครงสร้างของสารที่แยกได้ด้วยวิธี NMRและ mass spectra analysis เมื่อนำสาร sappanone A ที่สกัดได้มาทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้างเม็ดสีเมลานินและยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนส ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่ทำหน้าที่กระตุ้นการสร้างเม็ดสีเมลานิน บนเซลล์ mouse B16 melanoma cell (4A5) พบว่า สาร sappanone A สามารถยับยั้งการสร้างเม็ดสีเมลานิน และยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสได้ โดยผลของการยับยั้งเป็นแบบขึ้นกับขนาดความเข้มข้น (dose-dependent) (8)

ศึกษาฤทธิ์ยับยั้งการสร้างเม็ดสีเมลานินของสารสำคัญที่สกัดได้จากแก่นฝาง (ตัวอย่างจากประเทศญี่ปุ่น) โดยการนำแก่นฝางแห้งแช่สกัดในในเอทานอล 95% ที่อุณหภูมิห้อง กรองสารละลายผ่านกระดาษกรอง และทำให้สารสกัดเข้มข้นด้วยการลดความดันลงที่อุณหภูมิ 35๐C นำสารสกัดหยาบที่ได้มาละลายในน้ำ และสกัดแยกชั้นด้วยสารละลายเอ็น-เฮกเซน เอทิลอะซิเตท และเอ็น-บิวทานอล ซึ่งจะได้ส่วนสกัดเอ็น-เฮกเซน เอทิลอะซิเตท เอ็น-บิวทานอลและน้ำ นำส่วนสกัดเอทิลอะซิเตทที่ได้มาแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโครมาโทกราฟฟี จะได้สารสำคัญ 6 ชนิด คือ(6aS,11bR)-7,11b-dihydro-6H-indeno[2,1-c]chromene-3,6a,10,11-tetrol (1), sappanchalcone (2), 3′-deoxy-4-O-methylsappanol (3), brazilein(4), brazilin (5), sappanol (6)และ 4-O-methylsappanol (7) เมื่อนำสารสำคัญทั้ง 6 ชนิดมาทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้างเม็ดสีเมลานินบนเซลล์ HMV-II human melanoma พบว่า สาร (5) มีผลยับยั้งการสร้างเม็ดสีเมลานินได้ดีที่สุด โดยมีค่าความเข้มข้นในการยับยั้งการสร้างเมลานินลง 50% (EC50) เท่ากับ 3.0±0.5 ไมโครโมลาร์รองลงมาคือ และ (7), (4), (2), (3), (1), โดยมีค่า EC50เท่ากับ4.6±0.7, 18.6±1.1, 42.6±1.8, 50.4±2.0 และ 61.0±3.1 ไมโครโมลาร์ตามลำดับในขณะที่ (6) ไม่มีฤทธิ์ยับยั้งการสร้างเมลานิน (ค่า EC50 มากกว่า 100 ไมโครโมลาร์)และเมื่อพิจารณาความเป็นพิษต่อเซลล์ (cytotoxic) พบว่า สาร (2), (3), (4), (5) และ (7) มีความเป็นพิษต่อเซลล์ในระดับปานกลาง ในขณะที่ (5)เป็นพิษต่อเซลล์น้อยที่สุด นอกจากนี้ยังพบว่า สาร (5) มีผลยับยั้งการแสดงออกของโปรตีน tyrosinase-related protein (TYRP) 2 และเอนไซม์ tyrosinase ผลจากการศึกษาแสดงให้เห็นว่า สารสำคัญที่แยกสกัดได้จากแก่นฝาง 6 ชนิด (1-5 และ 7) มีฤทธิ์ยับยั้งการสร้างเม็ดสีเมลานิน โดยสาร brazilin (5) ให้ผลดีที่สุด และเหมาะที่จะนำไปใช้ประโยชน์ด้านเครื่องสำอางต่อไป (9)

ศึกษาฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสของสารสกัดจากแก่นฝางโดยซื้อตัวอย่างจากตลาดในเมือง Henan ประเทศจีน นำมาแช่สกัดในเมทานอล 70% ที่อุณหภูมิ 50๐C 3 ครั้ง (ครั้งที่ 1 นาน 2 ชม. ครั้งที่ 2 และ 3 นาน 1 ชม.) กรองเอาสารละลายและทำให้แห้งด้วยการระเหยแอลกอฮอล์ด้วยเครื่อง rotary evaporator นำสารสกัดหยาบที่ได้มาสกัดแยกชั้นด้วยวิธีโครมาโทกราฟีโดยใช้คอลัมน์ D101 macroporous resin และชะด้วยน้ำ, เมทานอล 20%, เมทานอล 40%, เมทานอล 60% และเมทานอล 100% จะได้ส่วนสกัด 5 ชนิดคือ น้ำ, เมทานอล 20%, เมทานอล 40%, เมทานอล 60% และเมทานอล 100%นำส่วนสกัด  เมทานอล 40% และ 60% มาแยกสกัดและทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธีโครมาโทกราฟีและ HPLC จะได้สารสำคัญ 8 ชนิด ได้แก่(3R,4S)-3-(3′,4′-hydroxybenzyl)-3,4-dihydro-2″,3″-dimethyl-3H-[1,3]dioxolo[4,5-c]chromen-7-ol (1), brazilin (2), protosappanin A (3), protosappanin C (4), protosappanin B (5), caesalpin J (6), sappanone B(7), และ sappanchalcone (8)นำสารสกัดหยาบ ส่วนสกัด 5 ชนิด และสารสำคัญ8 ชนิดที่สกัดได้ไปทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสด้วยวิธี tyrosinase activity assay พบว่าสารสกัดหยาบและส่วนสกัดเมทานอล 20% ทุกขนาด (2, 1, 0.25, 0.125 และ 0.0625 มก./มล.) มีผลกระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนส ส่วนสกัดน้ำที่ความเข้มข้นต่ำ (0.0625 มก./มล.) มีผลยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ แต่เมื่อเพิ่มความเข้มข้นจะมีผลกระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ ส่วนสกัดเมทานอล 40% และ 60% ที่ความเข้มข้น 0.25, 0.125 และ 0.0625 มก./มล. มีผลยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ แต่เมื่อเพิ่มความเข้มข้นขึ้นจะมีผลกระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ และส่วนสกัดเมทาอนอล 100% ที่ความเข้มข้น 0.0625, 1 และ 2 มก./มล.) มีผลยับยั้งการทำงานของเอนไซม์แต่ที่ความเข้มข้น0.125 และ 0.25 จะมีผลกระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ส่วนผลของสารสำคัญ 8 ชนิดพบว่า สาร (2) และ (7) ทุกขนาด (2, 1, 0.25, 0.125 และ 0.0625 มก./มล.) มีผลกระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนส ในขณะที่สาร(3)และ(6) ทุกขนาด มีผลยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ โดยประสิทธิภาพของสาร (3) จะเพิ่มตามปริมาณความเข้มข้น (concentration dose-dependent)ในขณะที่ (1), (4), (5) และ (8)จะให้ผลตรงข้ามกับปริมาณความเข้มข้นของสาร จากผลที่ได้ เมื่อวิเคราะห์ค่าจลศาสตร์ของเอนไซม์ (enzyme kinetics)พบว่าสาร (3) มีฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสแบบแข่งขัน ส่วนสาร (6) มีฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสแบบไม่แข่งขัน นอกจากนี้เมื่อนำสารสกัดหยาบ ส่วนสกัด 5 ชนิด และสารสำคัญ 8 ชนิดไปทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสในหนูแรทพบว่า การป้อนสารสกัดหยาบและส่วนสกัด 5 ชนิด(น้ำ, เมทานอล 20%, เมทานอล 40%, เมทานอล 60% และ เมทานอล 100%) ขนาด 1.15 ก./กก. มีผลลดระดับเอนไซม์ไทโรซิเนสในเลือดหนูลงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (ไม่ป้อนสารใด ๆ) ในขณะที่การฉีดสาร (2), (3), (5) และ(6) ขนาด 5 มก./กก.เข้าทางช่องท้องหนูแรทมีผลเพิ่มระดับเอนไซม์ไทโรซิเนสในเลือดหนูเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (ไม่ฉีดสารใดๆ) มีเฉพาะสาร (7) ที่มีผลลดระดับเอนไซม์ไทโรซิเนสในเลือดหนูลงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม จากผลการศึกษาจะเห็นได้ว่า ผลที่ได้จากการทดสอบในหลอดทดลองและสัตว์ทดลองให้ผลที่แตกต่างกันซึ่งอาจต้องมีการศึกษาถึงรายละเอียดเพิ่มเติม เพื่อให้ได้ข้อมูลในการเลือกสารสำคัญที่เป็นประโยชน์ในการพัฒนาผลิตภัณฑ์เครื่องสำอางที่ช่วยทำให้ผิวขาว (10)

ศึกษาฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสของสารสกัดจากเอทานอลแก่นฝางโดยนำตัวอย่างผงแก่นฝางแห้ง (ตัวอย่างจากประเทศอินโดนีเซีย) นำมาแช่สกัดในเมทานอล 70% โดยมีอัตราส่วนระหว่างผงตัวอย่างและสารละลายเท่ากับ 1:10 นาน 48ชม. จากนั้น กรองเอาสารละลายและทำให้เข้มข้นด้วยการระเหยแอลกอฮอล์ด้วยเครื่อง rotary evaporator นำสารสกัดเอทานอลแก่นฝางไปทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสด้วยวิธี tyrosinase activity assay พบว่าความเข้มข้นของสารสกัดที่มีผลลดการทำงานของเอนไซม์ลงครึ่งหนึ่งมีค่าเท่ากับ104 มคก./มล. ในขณะที่สารเปรียบเทียบ kojic acid และ ascorbicacid มีค่าเท่ากับ 44 และ 37 มคก./มล.ตามลำดับ เมื่อทำการศึกษาการแบบจำลองโมเลกุลของ (molecular docking)ระหว่างสาร brazilein และ brazilinซึ่งเป็นสารออกฤทธิ์ที่พบในแก่นฝางกับโปรตีนและเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องในกระบวนการสร้างเม็ดสีเมลานินได้แก่ เอนไซม์ไทโรซิเนส, tyrosinase related protein 1 และ D-dopachrome tauomerase ด้วยโปรแกรมคอมพิวเตอร์พบว่า สาร brazileinและ brazilin สามารถเข้าจับและสร้างพันธะเคมีกับโปรตีนและเอนไซม์ดังกล่าวทำให้มีผลลดการทำงานลง ผลจากการศึกษาแสดงให้เห็นว่า สารสกัดเอทานอลแก่นฝางมีฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนส แม้ประสิทธิผลที่ได้จะด้อยกว่าสารเปรียบเทียบ แต่ผลจากการศึกษาแบบจำลองโมเลกุลชี้ให้เห็นว่า หากทำการสกัดแยกสารออกฤทธิ์และทำให้บริสุทธิ์อาจมีผลเพิ่มฤทธิ์ในการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์เป้าหมายได้ (15)

2.2 ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ (S006)

ศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากแก่นฝาง โดยซื้อตัวอย่างจากตลาดในเมือง Semarang ประเทศอินโดนีเซีย (specimen no. 06001) นำแก่นฝางมาอบให้แห้งและบดเป็นผงก่อนนำมาแช่สกัดในเมทานอล นาน 12 ชม. 2 ครั้ง กรองสารสกัดด้วยกระดาษกรอง (Whatman no. 2) และทำให้เข้มข้นโดยการระเหยแอลกอฮอล์ที่อุณหภูมิ 30๐C ด้วยเครื่องเครื่อง rotary evaporator นำสารสกัดหยาบที่ได้ไปแยกสกัดในซิลิกาเจลคอลัมน์และชะด้วยสารละลายเฮกเซน เอทิลอะซิเตท และเมทานอล จะได้ส่วนสกัด 30 ส่วน ส่วนสกัดที่ได้จากการชะด้วยเอทิลอะซิเตทจะให้สารที่ประกอบด้วย brazilin (ส่วนสกัดที่ 4) protosappanin A (ส่วนสกัดที่ 5) sappanone B (ส่วนสกัดที่ 6-8) และสารประกอบอื่น ๆ นำมาทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี preparative HPLC [Inertsil ODS-3 column (21.5 x 300 มม.), mobile phase:  ระบบ gradient ของตัวทำละลายคือเมทานอลใน 0.5% trifluoroacetic acid เข้มข้น 5%-100% นาน 45 นาที, flow rate: 10 มล./นาที] สำหรับสาร brazilin ทำ preparative HPLC ซ้ำอีกครั้ง เพื่อให้ได้สารที่บริสุทธิ์มากขึ้น นำสารที่สกัดได้ทั้ง 3 ชนิดไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH)assay พบว่า สาร brazilinมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสะได้ดีที่สุด โดยมีค่าความเข้มข้นในการยับยั้งการเกิดอนุมูลอิสระลงครึ่งหนึ่ง (IC50)เท่ากับ 8.8±0.2 ไมโครโมลาร์ ในขณะที่protosappanin A และ sappanone B มีค่าเท่ากับ 9.1±0.4 และ 14.5±0.9 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับและสารเปรียบเทียบ (+)-catechin มีค่าเท่ากับ 10.2±0.1 ไมโครโมลาร์ (14)

ศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดแก่นฝางที่ประกอบด้วยสาร brazilin ไม่น้อยกว่า 40% (BRE) และสาร brazilin นำไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH พบว่า สารทั้ง 2 ชนิดมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ โดยสาร brazilin จะให้ผลดีกว่า BRE ซึ่งค่า IC50ของสาร brazilin และ BRE มีค่าเท่ากับ 5.6 และ 6.2 มคก./มล. ตามลำดับ (17)

ศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดแก่นฝางที่ประกอบด้วยสาร brazilin39% (BRE) โดยนำตัวอย่างแก่นฝางจาก จังหวัดชลบุรี ประเทศไทย (specimen no. SKP 098 03 19 01) มาล้างทำความสะอาด และอบให้แห้งที่อุณหภูมิ 60 ๐C นาน 24 ชม. บดเป็นผงละเอียดจากนั้นนำมาสกัดด้วยวิธีการสกัดแบบไหลย้อนกลับโดยใช้เอทานอล 95% เป็นตัวทำละลายนาน 1 ชม. และนำสารสกัดที่ได้ไปทำให้เข้มข้นด้วยการระเหยแอลกอฮอล์ภายใต้สภาวะความดันต่ำ สารสกัดหยาบที่ได้ (CSE) นำมาละลายในเอทานอล 35% กรองเอาส่วนใสมาสกัดแยกในคอลัมน์ Diaion HP-20 และชะด้วยเอทานอล 35% ทิ้งส่วนสกัดที่แยกได้ในช่วงแรก (2 ลิตร) และเก็บส่วนสกัดที่เหลือ (4 ลิตร) นำส่วนสกัดที่ได้ไปทำให้เข้มข้นด้วยการระเหยแอลกอฮอล์จะได้สารสกัด BRE ที่มีสาร brazilin เป็นส่วนประกอบ 39% นำสาร CSE และ BRE ที่สกัดได้มาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay พบว่า ค่าความเข้มข้นของ CSE และ BRE ที่มีผลยับยั้งการเกิดอนุมูลอิสระ 50% (EC50) มีค่าเท่ากับ 92.2±0.9 และ 60.5±0.2 มคก./มล. ตามลำดับ ในขณะที่สารเปรียบเทียบ brazilin และ quercetin มีค่าเท่ากับ 52.1±0.4 และ 17.4±0.4 มคก./มล. ตามลำดับผลการทดสอบด้วยวิธีreducing power พบว่า CSE และ BRE ที่ความเข้มข้น 10, 50 และ 100 มคก./มล.มีผลลดการเกิดอนุมูลอิสระโดยผลที่ได้ขึ้นกับขนาดความเข้มข้น และผลการทดสอบด้วยวิธีβ-carotene bleaching assayพบว่า BRE มีฤทธิ์ยับยั้งการเกิดอนุมูลอิสระโดยมีค่า EC50เท่ากับ 60.5มคก./มล.ใกล้เคียงกับสาร brazilin ที่มีค่า EC50เท่ากับ 52.1 มคก./มล.ผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าสาร BRE ที่สกัดได้จากแก่นฝางมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ (16)

ศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสาร brazilin และสารสกัดน้ำจากแก่นฝาง (ตัวอย่างจากประเทศเกาหลีใต้) โดยตากแก่งฝางให้แห้งและบดให้ละเอียด นำมาต้มในน้ำเดือด (100๐C) นาน 2 ชม. กรองเอาส่วนน้ำแล้วทำให้เข้มข้นโดยใช้เครื่อง rotary evaporator ส่วนสาร brazilin เตรียมได้จากการนำตัวอย่างผงแก่นฝางละลายในเมทานอลและนำไปสกัดแยกด้วยวิธี HPLC เมื่อนำสารสกัดน้ำแก่นฝาง และ brazilin มาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระบนเซลล์ human epidermal keratinocyte ที่ถูกกระตุ้นให้เกิดอนุมูลอิสระด้วยการฉายรังสียูวีเอ (ultraviolet A, UVA)พบว่าสารสกัดน้ำแก่นฝาง (20 มคก./มล.) และ brazilin (1 มคก./มล.) มีผลยับยั้งการสร้างอนุมูลอิสระ H2O2และเพิ่มการแสดงออกของเอนไซม์ glutathione peroxidase (GPX7) ซึ่งทำหน้าที่ในกระบวนการยับยั้งการเกิดอนุมูลอิสระ ผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าสารสกัดน้ำแก่นฝาง และ brazilin มีฤทธิ์ยับยั้งการเกิดอนุมูลอิสระบนเซลล์ผิวหนังที่เกิดจากการกระตุ้นด้วยรังสียูวีเอ อาจเป็นประโยชน์ในการพัฒนาเพื่อใช้ในผลิตภัณฑ์เครื่องสำอางได้ (19)

ศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากแก่นฝาง (ตัวอย่างจากประเทศอินเดีย)ชนิดต่างๆ ได้แก่ ปิโตรเลียมอีเทอร์, คลอโรฟอร์ม, เอทิลอะซิเตท, เมทานอล, เมทานอล 50% และน้ำ นำตัวอย่างผงแก่นฝางมาสกัดด้วย Soxhet extractor โดยใช้สารละลายปิโตรเลียมอีเทอร์, คลอโรฟอร์ม, เอทิลอะซิเตท และเมทานอล ใช้เวลาสกัดนาน 18-20 ชม. นำสารสกัดที่ได้ไปทำให้เข้มข้นด้วยการระเหยภายใต้สภาวะความดันต่ำที่อุณหภูมิ 40-50๐C สารสกัดเมทานอล 50% เตรียมได้จากการนำตัวอย่างผงแก่นฝางสกัดด้วย Soxhlet extractor และใช้เมทานอล 50% เป็นตัวทำละลาย ใช้เวลาสกัดนาน 18-20 ชม. นำสารสกัดที่ได้ไปทำให้เข้มข้นด้วยการลดความดันภายใต้อุณหภูมิ 40-50๐C และสารสกัดน้ำเตรียมด้วยวิธีไหลย้อนกลับนาน 2 ชม. โดยใช้น้ำเป็นตัวทำละลาย จากนั้นทำให้สารละลายเข้มข้นด้วยการระเหยภายใต้สภาวะความดันต่ำที่อุณหภูมิ 40-50๐C นำสารสกัดทั้งหมดมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay พบว่าสารสกัดเอทิลอะซิเตท เมทานอล เมทานอล 50% และน้ำ มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ โดยมีค่า IC50 เท่ากับ 1.71±0.15, 1.44±0.12, 2.31±0.17 และ 4.09±0.31 มคก./มล. ตามลำดับ ในขณะที่สารสกัดปิโตรเลียมอีเทอร์และคลอโรฟอร์มไม่มีฤทธิ์ดังกล่าว (ค่า IC50มากกว่า 1,000 มคก./มล.) และสารเปรียบเทียบ ascorbic acid และ rutin มีค่าเท่ากับ 2.85±0.20 และ 9.12±0.73 มคก./มล.ตามลำดับ เช่นเดียวกับการทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี nitric oxide ซึ่งพบว่า สารสกัดเอทิลอะซิเตท เมทานอล เมทานอล 50% และน้ำ มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ (ค่า IC50 เท่ากับ 50.25±4.02, 234.25±13.32, 39.50±3.32 และ 75.50±4.82 มคก./มล. ตามลำดับ) ส่วนสารสกัดปิโตรเลียมอีเทอร์และคลอโรฟอร์มไม่มีฤทธิ์ดังกล่าว (ค่า IC50มากกว่า 1,000 มคก./มล.) และสารเปรียบเทียบ rutin มีค่า IC50เท่ากับ 172.65±14.06 มคก./มล. และเมื่อนำสารสกัดน้ำและเมทานอลมาทดสอบในสัตว์ทดลองด้วยการป้อนให้แก่หนูแรทขนาดวันละ 50 และ 100 มก./กก. ติดต่อกัน 4 วัน ก่อนฉีดสาร carbon tetrachloride (CCl4) เข้าทางช่องท้อง พบว่า สารสกัดน้ำและเมทานอลทั้ง 2 ขนาด มีผลเพิ่มการทำงานของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องในกระบวนการต้านอนุมูลอิสระ (superoxide dismutase และ catalase) ขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (ฉีด CCl4อย่างเดียว) และลดการเกิด thiobarbituric acid reactive substance ซึ่งบ่งชี้ถึงการเกิดอนุมูลอิสระ ทั้งในตัวอย่างเนื้อเยื่อตับและไต ผลจากการศึกษาแสดงให้เห็นว่าสารสกัดจากแก่นฝางมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ (23)

ศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดน้ำแก่นฝางโดยนำตัวอย่างแก่นฝาง (ตัวอย่างจากจังหวัดเชียงใหม่ ประเทศไทย)มาล้างทำความสะอาดและหั่นให้เป็นชิ้นเล็ก ๆ นำมาอบให้แห้งที่อุณหภูม 50๐C บดให้เป็นผงละเอียดนำผงแก่นฝางมาแช่สกัดในน้ำที่ผ่านกระบวนการกำจัดอิออนของสารละลายทั้งหมด (deionized water) คนเบาๆ ที่อุณหภูมิห้อง นาน 24 ชม. กรองสารละลายด้วยกระดาษกรองเบอร์ 1 จากนั้นทำให้แห้งด้วยวิธีแช่เยือกแข็ง (freeze dry) นำสารสกัดน้ำแก่นฝางที่ได้มาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPHassay, ABTS assay และferric reducing antioxidant power (FRAP) assay พบว่า สารสกัดน้ำแก่นฝางมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระสูง โดยมีค่าความเข้มข้นในการยับยั้งการเกิดอนุมูลอิสระลงครึ่งหนึ่งเท่ากับ 5.12±3.2 ไมโครโมลาร์ เมื่อทดสอบด้วยวิธี DPPH assayและการทดสอบด้วยวิธี FRAB assay และ ABTS assay พบว่า มีค่าความเข้มข้นในการยับยั้งการเกิดอนุมูลอิสระเท่ากับ 78.7±2.4 มิลลิโมลาร์ เทียบเท่ากับ Fe2+/มก. ของสารสกัด และ 64.8±4.2 มคก. เทียบเท่ากับ trolox/มก. ของสารสกัดตามลำดับ (24)

2.3 ฤทธิ์ต้านการอักเสบ (S014)

ศึกษาฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดจากแก่นฝาง โดยซื้อตัวอย่างจากตลาดในจังหวัด Hebei ประเทศจีน [specimen no. M-6-(5)]นำแก่นฝางแห้งมาสับละเอียดและแช่สกัดในเอทานอลเข้มข้น 95% ทั้งหมด 3 ครั้ง นำสารสกัดหยาบที่ได้ละลายในน้ำ และแยกสกัดต่อด้วยสารละลายชนิดต่างๆได้แก่ ปิโตรเลียมอีเทอร์ เอทานอล และบิวทานอล นำส่วนสกัดเอทานอลไปแยกส่วนสกัดโดยใช้silica gel column chromatography ระบบ gradient ของสารละลายคือคลอโรฟอร์มและเมทานอล ซึ่งสามารถแยกส่วนสกัดออกมาได้ 12 ส่วน นำส่วนสกัดที่ 5 มาแยกส่วนสกัดอีกครั้งด้วย silica gel column chromatography และชะด้วยสารละลายปิโตรเลียมอีเทอร์:เอทิลอะซิเตท (3:1-1:1)จะได้ส่วนสกัดย่อย 6 ส่วน (5a-f) นำส่วนสกัดย่อย 5e มาแยกในsilica gel column และชะด้วยสารละลายคลอโรฟอร์ม:เมทานอล (25:1-10:1)จะได้ส่วนสกัด 5ea-ed นำส่วนสกัด 5ec มาผ่านคอลัมน์ Sephadex LH-20 และชะด้วยสารละลายคลอโรฟอร์ม:เมทานอล (1:1) จากนั้น นำไปทำให้สารบริสุทธิ์ด้วยวิธี semi-preparative HPLC (สารละลายเมทานอล:น้ำ อัตราส่วน 85:15) จะได้สารประกอบชนิดที่ 1 ส่วนสกัดที่ 8 นำมาแยกสกัดด้วย silica gel column chromatography และชะด้วยสารละลายคลอโรฟอร์ม:Me2CO (10:1-1:1)จะสามารถแยกส่วนสกัดได้ 8 ส่วน(8a-h) นำส่วนสกัด 8d มาแยกใน silica gel column และชะด้วยสารละลายคลอโรฟอร์ม:เมทานอล (20:1-5:1)จะได้ส่วนสกัดย่อย 8da-df นำส่วนสกัด 8db มาแยกในคอลัมน์ MCI และชะด้วยสารละลายMe2CO:น้ำ (30:70-100:0) จะได้สารประกอบชนิดที่ 2 นำสารประกอบทั้ง 2 ชนิดที่แยกได้วิเคราะห์โครงสร้างด้วยวิธี spectroscopic analysis ร่วมกับ mass spectral data พบว่า สารประกอบที่ 1 และ 2 คือ epicaesalpin J และ 7,10,11-trihydroxydracaenone เมื่อนำมาทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบบนเซลล์ BV-2 microglia ที่ถูกกระตุ้นให้เกิดกระบวนการอักเสบด้วย lipopolysaccharide (LPS) พบว่า สารทั้ง 2 ชนิดมีฤทธิ์ยับยั้งการสร้าง nitric oxide (NO) ซึ่งบ่งชี้ถึงภาวะอักเสบ โดยมีค่าความเข้มข้นในการยับยั้งการสร้าง NO ลงครึ่งหนึ่ง (IC50) เท่ากับ 52.62 และ 56.71 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ ในขณะที่สารเปรียบเทียบ quercetin มีค่าเท่ากับ 23.42 ไมโครโมลาร์แสดงให้เห็นว่าสาร epicaesalpin J และ 7,10,11-trihydroxydracaenone ที่สกัดได้จากแก่นฝางมีฤทธิ์ต้านการอักเสบ (11)

ศึกษาฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดแก่นฝางที่ประกอบด้วยสาร brazilin (BRE) โดยนำตัวอย่างแก่นฝางจากจังหวัดชลบุรี ประเทศไทย (specimen no. SKP 098 03 19 01) พบว่า สารสกัดแอลกอฮอล์หยาบที่ได้ (CSE) และสารสกัด BRE ที่มีสาร brazilin เป็นส่วนประกอบ 39% เข้มข้น 0.1 มคก./มล. มีฤทธิ์ต้านการอักเสบ จากการทดสอบด้วยวิธี anti-denaturation assay โดยมีเปอร์เซ็นต์การยับยั้งการเสียสภาพโปรตีน (inhibiting protein denaturation) เท่ากับ 54.1 และ 61.9% ตามลำดับ (16)

ศึกษาฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดจากแก่นฝาง โดยซื้อตัวอย่างจากตลาดในเมือง Daegu ประเทศเกาหลีใต้ (specimen no.COD-3174)นำแก่นฝางมาสกัดด้วยวิธีการสกัดแบบไหลย้อนกลับโดยใช้เมทานอลเป็นตัวทำละลาย จากนั้นทำการระเหยแอลกอฮอล์ออก นำสารสกัดส่วนที่เหลือกระจาย (suspend)ในน้ำ และแยกสกัดต่อด้วยสารละลายชนิดต่างๆได้แก่เอ็น-เฮกเซน, เอทิลอะซิเตท และเอ็น-บิวทานอล นำส่วนสกัดเอทิลอะซิเตทไปแยกสกัดต่อด้วยวิธีคอลัมน์โครมาโทกราฟี และทำให้สารสกัดบริสุทธิ์ด้วยวิธี semipreparative HPLC จะได้สารประกอบฟีนอลิก4 ชนิด คือ caesalpiniaphenol A, caesalpiniaphenol B, caesalpiniaphenol C และ caesalpiniaphenol D นำสารที่ได้ไปทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบบนเซลล์แมคโครฟาจ RAW264.7 ที่ถูกกระตุ้นด้วย LPSพบว่า สาร caesalpiniaphenol D มีฤทธิ์ยับยั้งการสร้าง NO ซึ่งบ่งชี้ถึงภาวะอักเสบ โดยมีค่าความเข้มข้นในการยับยั้งการสร้าง NO ลงครึ่งหนึ่ง (IC50) เท่ากับ 12.25±1.5 ไมโครโมลาร์ ในขณะที่สารชนิดอื่นไม่แสดงฤทธิ์ดังกล่าว (ค่า IC50มากกว่า 50 ไมโครโมลาร์) และ สารเปรียบเทียบ celastrol มีค่า IC50เท่ากับ 1.0±0.1 ไมโครโมลาร์ (12)

ศึกษาฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดจากแก่นฝางโดยเก็บตัวอย่างจากจังหวัดเชียงใหม่ (specimen no. 87-1631) นำผงแก่นฝางมาสกัดด้วยเครื่อง soxhlet โดยใช้เอทานอล 95% เป็นตัวทำละลาย นาน24 ชม. จากนั้นทำสารสกัดให้เข้มข้นขึ้นภายใต้สุญญากาศด้วยเครื่อง rotary evaporator นำสารสกัดเอทานอลแก่นฝางที่สกัดได้มาทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบบนเซลล์ SW1353 chondrocyte และ THP-1 macrophage ที่ถูกกระตุ้นให้เกิดกระบวนการอักเสบด้วย interleukin 1β(IL-1β)และ LPS  ตามลำดับ พบว่า สารสกัดเอทานอลแก่นฝางเข้มข้น5 มคก./มล. มีผลยับยั้งการแสดงออกของ IL-1βและ tumor necrosis factor α (TNF-α) ในเซลล์ THP-1 macrophage เช่นเดียวกับผลในเซลล์ SW1353 chondrocyte ซึ่งพบว่า สารสกัดเอทานอลแก่นฝางเข้มข้น 10 และ 20 มคก./มล. มีผลยับยั้งการแสดงออกของ IL-1β และ TNF-αโดยผลที่ได้ขึ้นกับความเข้มข้นนอกจากนี้ยังมีผลยับยั้งการสร้าง NO และลดการแสดงออกของเอนไซม์ nitric oxide synthase (iNOS) และ cyclooxygenase 2 (COX-2) แสดงให้เห็นว่า สารสกัดเอทานอลจากแก่นฝางมีฤทธิ์ต้านการอักเสบ (25)

ศึกษาฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดจากแก่นฝางโดยเก็บตัวอย่างจากจังหวัดเชียงใหม่ (specimen no.87-1631) นำผงแก่นฝางแช่สกัดในเอทานอล นาน 24 ชม. กรองสารละลาย และทำให้สารสกัดเข้มข้นขึ้นภายใต้สุญญากาศด้วยเครื่อง rotary evaporator นำสารสกัดที่ได้ละลายในเอทานอล 20% และนำไปแยกสกัดสารสำคัญด้วยวิธี preparative HPLC จะได้สารออกฤทธิ์ 5 ชนิด ได้แก่episappanol, protosappanin C, brazilin, (iso-)protosappanin B และ sappanol นำสารที่สกัดได้ทั้งหมดมาทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบบนเซลล์แมคโครฟาจ RAW 264.7 ที่ถูกกระตุ้นให้เกิดภาวะอักเสบด้วย LPS พบว่าสารออกฤทธิ์ทั้ง 5 ชนิด (ความเข้มข้น 5-50 มคก./มล.) มีฤทธิ์ต้านกระบวนการอักเสบ โดยมีผลยับยั้งการแสดงออกของโปรตีนที่ตอบสนองต่อการอักเสบได้แก่ IL-6 และ TNF-α เช่นเดียวกับการทดสอบบนเซลล์ human chondrocytes ที่ถูกกระตุ้นด้วย IL-1β ซึ่งพบว่า สารออกฤทธิ์ทุกชนิดมีผลยับยั้งการแสดงออกของ IL-6 และ TNF-α โดยสารที่ออกฤทธิ์ได้ดีที่สุดคือ brazilin (7)

10.2.4ฤทธิ์รักษาแผล (S015)

ศึกษาฤทธิ์รักษาแผลของสารสกัดแก่นฝางที่ประกอบด้วยสาร brazilinไม่น้อยกว่า 40% (BRE) และสาร brazilin โดยนำไปทดสอบบนเซลล์ผิวหนัง human fibroblast พบว่า สารสกัด BRE และ brazilin ความเข้มข้นไม่เกิน 500 มคก./มล. ไม่ก่อให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ และการให้ขนาดความเข้มข้นเกิน 500 มคก./มล. ส่งผลเป็นพิษต่อเซลล์ โดย brazilin มีแนวโน้มเป็นพิษต่อเซลล์มากกว่า BRE ดังนั้นจึงได้ทำการเลือกสาร BRE มาทำการทดสอบผลต่อการเจริญและเคลื่อนที่ (migration)ของเซลล์ human fibroblast ซึ่งพบว่า สารสกัด BRE เข้มข้น 250 มคก./มล. มีผลเพิ่มจำนวนเซลล์และการเคลื่อนที่ของเซลล์ในวันที่ 2 ของการทดลองเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (เลี้ยงเซลล์ด้วยอาหารเลี้ยงเซลล์ปกติไม่มีสาร BRE) แสดงให้เห็นว่า สารสกัด BRE จากแก่นฝางมีผลต่อการเจริญของเซลล์ผิวหนังซึ่งอาจมีประโยชน์ในการพัฒนาเพื่อเป็นยารักษาแผลได้ (17)

3 การศึกษาเกี่ยวกับริมฝีปากและช่องปาก

3.1 ฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียก่อโรคในช่องปาก (L001)

ศึกษาฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียที่ก่อโรคในช่องปากของสารสกัดจากแก่นฝาง โดยนำตัวอย่างแก่นฝาง(ตัวอย่างจากจังหวัดเชียงใหม่ ประเทศไทย) มาอบให้แห้งที่อุณหภูม 50๐C บดให้เป็นผงละเอียดนำผงแก่นฝางมาแช่สกัดในเมทานอล 95% นาน 24 ชม.3 ครั้ง กรองเอาสารละลาย จะได้สารสกัดเอทานอลแก่นฝาง (Cs-EtOH)นำสารสกัดที่ได้ไปทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียที่ก่อโรคในช่องปากได้แก่ Streptococcus mutans DMST9567 (Smu9), Streptococcus mutans DMST41283 (Smu4) และ Streptococcus intermedius DMST42700 (Si) ด้วยวิธี broth microdilution method พบว่าสารสกัด Cs-EtOH มีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของเชื้อแบคทีเรีย โดยมีค่า diameter inhibition zone เท่ากับ17.5 ± 0.5, 18.5 ± 0.0และ17.0 ± 0.0 มม. สำหรับเชื้อSmu9, Smu4 และSi ตามลำดับ และเมื่อนำผงแก่นฝางแช่สกัดในเฮกเซน นาน 48 ชม. 3 ครั้ง กรองเอาสารละลาย และปล่อยให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง (24 ชม.) นำส่วนที่เหลือมาแยกสกัดในสารละลาย 3 ชนิด ได้แก่ เอ็น-เฮกเซน, เอทิลอะซิเตท และเอทานอล ด้วยวิธีแช่สกัดที่อุณหภูมิห้อง นาน 48 ชม. กรองเอาสารละลาย และนำไปทำให้เข้มข้นภายใต้สุญญกาศ ที่อุณหภูมิ 45๐C ด้วยเครื่อง rotary evaporator จะได้ส่วนสกัดเฮกเซน (F-Hexane), เอทิลอะซิเตท (F-EtOAc) และเอทานอล (F-EtOH) นำส่วนสกัดทั้งหมดมาทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียที่ก่อโรคในช่องปาก Smu, Smu4 และ Si พบว่า F-EtOH มีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของเชื้อแบคทีเรียได้ดีที่สุด โดยมีค่า MBC อยู่ระหว่าง 124-250 มคก./มล. ซึ่งผลในการยับยั้งเชื้อขึ้นอยู่กับสายพันธุ์ของเชื้อและความเข้มข้นของส่วนสกัด เมื่อนำส่วนสกัด F-EtOH มาแยกสกัดต่อด้วยวิธีคอลัมน์โครมาโทกราฟี และชะด้วยสารละลายคลอโรฟอร์มและเมทานอล (อัตราส่วน 75:25) จะได้ส่วนสกัดย่อย 11 ชนิด (F1-F11) เมื่อนำมาทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียที่ก่อโรคในช่องปาก Smu, Smu4 และ Si พบว่า F6 มีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อแบคทีเรียได้ดีที่สุด ผลจากการศึกษาแสดงให้เห็นว่า สารสกัดจากแก่นฝางมีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียที่ก่อโรคในช่องปาก ซึ่งอาจนำไปพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์เพื่อสุขภาพในช่องปากได้ (26)

พบรายงานความเป็นพิษของสาร brazilin จากแก่นฝาง ในผู้ป่วยเพศหญิงอายุ 49 ปี โดยมีอาการผื่นแพ้ผิวหนัง จากการสอบถามพบว่า ผู้ป่วยได้ใช้ตำรับยาต้มสมุนไพรประคบเพื่อรักษาอาการข้อมือเคล็ดเป็นเวลานานประมาณ 30นาที และ ได้แช่มือในตำรับยาต้มดังกล่าวอีก 20 นาที หลังจากนั้น 1 วัน บริเวณมือของผู้ป่วยเริ่มมีอาการเกิดผื่นแดง ผิวไหม้ และคัน ซึ่งสมุนไพรที่เป็นส่วนประกอบในตำรับ ได้แก่ ฝาง (Caesalpinia sappan) หญ้าฝรั่น (Crocus sativus) และชั่งชิก (Panax notoginseng) ทำการเตรียมสารสกัดจากสมุนไพรทั้ง 3 ชนิด โดยนำผงสมุนไพรแช่สกัดในน้ำที่ผ่านกระบวนการกำจัดอิออนทั้งหมด นาน 24 ชม. ทำการเจือจางสารสกัดให้ได้ความเข้มข้น 50, 20 และ 10% นำมาทดสอบการแพ้ในผู้ป่วยด้วยวิธี patch test พบว่า สารสกัดน้ำจากแก่นฝางให้ผลเป็นบวกในทุกความเข้มข้น จากนั้นจึงทำการทดสอบสารสำคัญที่พบในแก่นฝาง 2 ชนิด ได้แก่ brazilin และ protosappanin B โดยเจือจางให้มีความเข้มข้น 10% และทดสอบการแพ้ในผู้ป่วยด้วยวิธี patch test พบว่า สาร brazilin ให้ผลเป็นบวก จึงสามารถสรุปได้ว่า สาร brazilin จากแก่นฝางทำให้เกิดอาการผื่นแพ้ผิวหนังในผู้ป่วย และแพทย์ได้ทำการรักษาโดยใช้ยาทา corticosteroids (27)

ศึกษาความเป็นพิษเฉียบพลัน และความเป็นพิษกึ่งเฉียบพลันของสารสกัดน้ำจากแก่นฝาง (ตัวอย่างจากร้านเวชพงษ์โอสถ กรุงเทพฯ) โดยนำแก่นฝาง 1 กก. มาสับให้เป็นชิ้นเล็ก ๆ แล้วต้มในน้ำเดือด 10 ลิตร นาน 30 นาที กรองเอาแต่น้ำ ทำซ้ำทั้งหมด 3 ครั้ง นำสารสกัดนำที่ได้มาเทรวมกัน จากนั้นทำให้แห้งด้วยการแช่เยือกแข็ง การศึกษาความเป็นพิษเฉียบพลันทำโดยป้อนสารสกัดน้ำแก่นฝางให้แก่หนูแรทขนาด 5,000 มก./กก. เพียงครั้งเดียว ส่วนการศึกษาความเป็นพิษกึ่งเฉียบพลันทำโดยป้อนสารสกัดน้ำแก่นฝางให้แก่หนูแรทขนาดวันละ 250, 500 และ 1,000 มก./กก. นานติดต่อกัน 30 วัน ผลการศึกษาความเป็นพิษเฉียบพลันพบว่า การป้อนสารสกัดน้ำแก่นฝางให้แก่หนูแรทขนาด 5,000 มก./กก. ไม่ทำให้หนูตายและไม่ส่งผลต่อพฤติกรรม หรือการเปลี่ยนแปลงของอวัยวะภายใน ส่วนผลการศึกษาความเป็นพิษกึ่งเฉียบพลันพบว่า สารสกัดน้ำจากแก่นฝางทุกขนาด ไม่ทำให้หนูตาย ไม่ส่งผลต่อพฤติกรรมและน้ำหนักตัว ไม่มีผลเปลี่ยนแปลงค่าโลหิตวิทยา และเมื่อผ่าพิสูจน์ซาก ไม่พบความผิดปกติของอวัยวะภายใน จากผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่า สารสกัดน้ำจากแก่นฝางไม่ก่อให้เกิดความเป็นพิษต่อสัตว์ทดลองทั้งแบบความเป็นพิษเฉียบพลันและกึ่งเฉียบพลัน (28)

ยังไม่มีรายงานข้อห้ามใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง

อาจก่อให้เกิดอาการผื่นแพ้ผิวหนังในผู้ใช้บางราย (27)

อาจก่อให้เกิดอาการผื่นแพ้ผิวหนังในผู้ใช้บางราย (27)

ไม่มีข้อมูลเนื่องจากยังไม่มีรายงานการศึกษาในคนมีเพียงการศึกษาในหลอดทดลองหรือสัตว์ทดลอง

DIP (THAILAND-TH)

USPTO (USA)