ข้อกำหนดทางกายภาพ-เคมีของเหง้ากระชายดำ

1. เอกลักษณ์ทางเคมี (Chemical identification) 

การตรวจสอบเบื้องต้น (Preliminary test) (1)

ผงแห้งจากเหง้ากระชายดำ 1 ก. นำมาสกัดด้วยวิธีสกัดแบบไหลย้อนกลับ (reflux) ด้วย 95% เอทานอล จำนวน 20 มล. เป็นเวลา 5 นาที กรอง นำสารละลายตัวอย่างที่ได้จากการกรอง ไปทดสอบตามหัวข้อต่าง ๆ ดังนี้

ก. การตรวจสอบสารกลุ่ม terpenoids (Color reaction)

นำสารละลายตัวอย่าง 5 มล. เติมผงถ่าน 1 ก. เขย่าให้เข้ากันแล้วกรอง นำสารละลายที่กรองได้มาเติม vanillin-sulfuric acid TS* 2 หยด ผสมให้เข้ากัน แล้วนำหลอดทดลองไปวางบนอ่างอังไอน้ำเป็นเวลา 2 นาที จะสังเกตเห็นสารละลายสีน้ำเงิน

*vanillin-sulfuric acid TS เตรียมโดยละลาย vanillin 1 ก. ใน ethanolic sulfuric acid solution (เตรียมโดยเจือจาง concentrated sulfuric acid ด้วย 95% ethanol ความเข้มข้น 5% โดยปริมาตร) 100 มล. เตรียมแล้วใช้ทันที

ข. การตรวจสอบสารกลุ่ม anthocyanins (Color reaction)

นำสารละลายตัวอย่าง 2 มล. มาเติมสารละลาย 5% potassium hydroxide โดยน้ำหนักต่อปริมาตร 1 หยด สารละลายจะเปลี่ยนเป็นสีเขียวถึงสีน้ำเงิน เมื่อเติมสารละลาย 20% sulfuric acid โดยปริมาตร 1 หยด พบว่าสารละลายจะเปลี่ยนเป็นสีแดง

ค. การตรวจสอบสารกลุ่ม amines/amino acids (Ninhydrin test)

หยดสารละลายตัวอย่าง 2 หยด โดยหยดครั้งละ 1 หยดลงบนแผ่นกระดาษกรอง ทิ้งให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง หยดสารละลาย ethanolic ninhydrin TS* 1 หยด ทับลงไป จากนั้นทำให้แห้งด้วยไอร้อนจะปรากฏสีม่วง (violet) เกิดขึ้นบนกระดาษกรอง

*ethanolic ninhydrin TS เตรียมโดยละลาย ninhydrin 1 ก. ใน 95% ethanol 50 มล. แล้วเติม glacial acetic acid 10 มล.

ง. การตรวจสอบสารกลุ่ม flavonoids (Shinoda’s test)

นำสารละลายตัวอย่าง2 มล. มาเติม magnesium ribbon 1 ชิ้น จากนั้นเติม concentrated hydrochloric acid 2 หยด แล้วนำหลอดทดลองไปวางในอ่างอังไอน้ำชั่วขณะสารละลายจะเปลี่ยนเป็นสีแดง

การตรวจสอบเพื่อยืนยันผล (Confirmatory test) (1, 19)

ตรวจสอบด้วยวิธี Thin-Layer chromatography (TLC)

สารละลายตัวอย่าง: ผงเหง้ากระชายดำ 0.5 ก. นำมาเติมเมทานอล 10 มล. ต้มให้เดือด (reflux) 5 นาที ตั้งทิ้งไว้ให้เย็นแล้วกรอง นำสารละลายที่ได้มาปรับปริมาตรด้วยเมทานอลจนครบ 10 มล.

วัฏภาคคงที่: TLC plate silica gel GF254, 0.25 mm thickness

วัฏภาคเคลื่อนที่: hexane : ethyl acetate : formic acid (60:30:5)

ถังทำโครมาโตกราฟี: ใส่วัฏภาคเคลื่อนที่ลงในถังให้มีความสูงจากก้นถังประมาณ 1 ซม. ทิ้งไอย่างน้อย 1 ชม. ก่อนใช้

น้ำยาตรวจสอบ: Natural products-polyethylene glycol (NP/PEG) reagent

1) NP reagent ละลายสาร diphenylboric acid-2-aminoethyl ester 1 ก. ในเมทานอล 100 มล.

2) PEG reagent ละลาย polyethylene glycol 4000 ปริมาณ 5 ก. ใน 95% ethanol

วิธีการ: ใช้ capillary tube ดูดสารละลายตัวอย่าง 5 มคล. มาหยดบนแผ่น TLC ในแนวระดับเดียวกัน ให้ห่างจากขอบล่างของแผ่น TLC ประมาณ 2 ซม. ผึ่งให้แห้ง นำไปใส่ในถังทำโครมาโตกราฟีที่เตรียมไว้ ตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้องให้วัฏภาคเคลื่อนที่ซึมขึ้นไปตามผิวฉาบสูง 10 ซม. นำแผ่น TLC ออกจาก ถังทำโครมาโตกราฟี ทิ้งไว้ให้แห้ง แล้วนำไปตรวจสอบ ดังนี้

1. ส่องภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต ที่ความยาวคลื่น 254 นาโนเมตร(UV254)

2. ส่องภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต ที่ความยาวคลื่น 366 นาโนเมตร (UV366)

3. นำแผ่น TLC ไปอุ่นที่อุณหภูมิ 80OC เป็นเวลานาน 10 นาที แล้วพ่นด้วย NP reagent ก่อนพ่นทับด้วย PEG reagent สังเกตแผ่น TLCภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต ที่ความยาวคลื่น 366 นาโนเมตร 

ผลการตรวจสอบ: จากการตรวจสอบด้วยTLC โดยตำแหน่งของแถบสีต่างๆ บนแผ่น TLC จะแสดงด้วยค่า hRf (100Rf) โดยที่ Rf (retardation factor หรือ relative front) หมายถึง อัตราส่วนระยะทางที่สารเคลื่อนที่ต่อระยะทางที่วัฏภาคเคลื่อนที่เคลื่อนที่ไป ค่า hRf และผลการตรวจสอบมีดังนี้

• ภายใต้ UV254ค่า hRf17-26 มีสีน้ำเงิน, ค่า hRf29-35, 36-40, 41-46,46-52 มีสีม่วง และค่า hRf64-69, 74-78, 78-82, 83-86, 87-90 มีสีดำ (quenching) 

• ภายใต้ UV366ก่อนพ่นด้วย NP/PEG reagentค่า hRf 17-26, 29-35, 36-40, 41-46, 46-52 มีสีน้ำเงิน 

• ภายใต้ UV366หลังพ่นด้วย NP/PEG reagentค่า hRf 17-26, 29-35, 36-40, 41-46, 46-52 มีสีน้ำเงิน, ค่า hRf 64-69, 78-82, 83-86 มีสีเหลือง, ค่า hRf 74-78 มีสีเขียวหลือง, และ ค่า hRf 87-90 มีสีส้ม 

2. ปริมาณความชื้น 

ไม่เกินร้อยละ 10.0 โดยปริมาตรต่อน้ำหนัก (Azeotropic distillation method) ตามวิธีที่ระบุใน Thai Herbal Pharmacopoeia 

3. ปริมาณสิ่งแปลกปลอม

ไม่เกินร้อยละ 2.0 โดยน้ำหนัก ตามวิธีที่ระบุใน Thai Herbal Pharmacopoeia

4. ปริมาณเถ้าที่ไม่ละลายในกรด 

ไม่เกินร้อยละ 2.0 โดยน้ำหนัก ตามวิธีที่ระบุใน Thai Herbal Pharmacopoeia

5. ปริมาณเถ้ารวม

ไม่เกินร้อยละ 6.0 โดยน้ำหนัก ตามวิธีที่ระบุใน Thai Herbal Pharmacopoeia

6. ปริมาณสารสกัดด้วยเอทานอล 

ไม่น้อยกว่าร้อยละ 8.0 โดยน้ำหนัก ตามวิธีที่ระบุใน Thai Herbal Pharmacopoeia

7. ปริมาณสารสกัดด้วยน้ำ 

ไม่น้อยกว่าร้อยละ 17.0 โดยน้ำหนัก ตามวิธีที่ระบุใน Thai Herbal Pharmacopoeia

ข้อกำหนดทางกายภาพเคมีของน้ำมันหอมระเหยจากเหง้ากระชายดำ (1, 20)

1. การละลาย (solubility)

น้ำมันหอมระเหยจากเหง้ากระชายดำละลายได้ดีใน 95% ethanol, ethyl acetate, chloroform, และ hexane

2. ค่าดัชนีหักเหของแสง (refractive index)

อยู่ในช่วง 1.471-1.476 ที่อุณหภูมิ 20 OC

3. ค่าความหนาแน่นสัมพัทธ์ (relative density)

อยู่ในช่วง 0.980-0.983 ที่อุณหภูมิ 20 OC

4. เอกลักษณ์ทางเคมี (Chemical identification)

4.1 การเตรียมน้ำมันหอมระเหย

สกัดน้ำมันหอมระเหยโดยนำเหง้ากระชายดำสด 1 กก.มาหั่นเป็นชิ้น แล้วกลั่นด้วยน้ำ นาน 2 ชม. เก็บน้ำมันหอมระเหยที่กลั่นได้ในภาชนะปิดสนิทและป้องกันแสง เก็บที่อุณหภูมิ 4 OC

4.2 การตรวจสอบเบื้องต้น (Preliminary test)

นำน้ำมันหอมระเหย 1 หยด มาเติม 95% ethanol 0.5 มล. ผสมให้เข้ากัน เติม vanillin-sulfuric acid TS 2 หยด สารละลายจะเปลี่ยนเป็นสีม่วงแดง (purple)

4.3 การตรวจสอบเพื่อยืนยันผล (Confirmatory test)

4.3.1 การตรวจสอบด้วยวิธี Thin-Layer chromatography (TLC)

สารละลายตัวอย่าง: น้ำมันหอมระเหยจากเหง้ากระชายดำ 10 มคล. ละลายด้วย 95% ethanol จนครบ 200 มคล.

สารละลายมาตรฐาน: borneol 4 มก. ละลายใน ethyl acetate 1 มล.

วัฏภาคคงที่: TLC plate silica gel G, 0.25 mm thickness

วัฏภาคเคลื่อนที่: hexane : ethyl acetate : acetic acid (90:10:1)

ถังทำโครมาโตกราฟี: ใส่น้ำยาแยกลงในถังให้มีความสูงจากก้นถังประมาณ 1 ซม. ทิ้งไว้อย่างน้อย1 ชม. ก่อนใช้

วิธีการ:ใช้ capillary tube ดูดสารละลายตัวอย่างและสารละลายมาตรฐาน ชนิดละ 1 มคล. มาหยดบนแผ่น TLC ในแนวระดับเดียวกัน ให้ห่างจากขอบล่าง ของแผ่น TLC ประมาณ 2 ซม. และให้มีระยะห่างระหว่างหยดสารละลายแต่ละชนิดไม่น้อยกว่า 1 ซม. ผึ่งให้แห้ง นำไปตั้งในถังทำโครมาโตกราฟีที่เตรียมไว้ ตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง ให้วัฏภาคเคลื่อนที่ซึมขึ้นไปตามผิวฉาบสูง 15 ซม. นำแผ่น TLC ออกจากถังทำโครมาโตกราฟี ทิ้งไว้ให้แห้ง แล้วนำไปตรวจสอบ

น้ำยาตรวจสอบ: vanillin-phosphoric acid TS เตรียมโดยละลาย vanillin 1 ก. ในเอทานอล 25 มล. และ ortho-phosphoric acid 35 มล. ตามลำดับ เตรียมทันทีก่อนใช้

การตรวจสอบ: พ่นแผ่น TLC ด้วย vanillin-phosphoric acid TS จากนั้นให้ความร้อนที่ 120 OC เป็นเวลานาน 10 นาที แล้วสังเกตภายใต้แสงธรรมชาติ และแสง

อัลตราไวโอเลตที่ความยาวคลื่น 366 นาโนเมตร

ผลการตรวจสอบ: หลังพ่นด้วย vanillin-phosphoric acid TS ค่า hRf และผลการตรวจสอบมีดังนี้

• ภายใต้แสงธรรมชาติค่า hRf9-12, 69-72 มีสีม่วง,ค่า hRf 26-28 มีสีม่วงน้ำเงิน,ค่า hRf31-34 มีสีม่วงน้ำตาล, ค่า hRf 41-43 มีสีแดง,ค่า hRf71-77 มีสีเหลืองและค่า hRf92-96 มีสีม่วงแดง

• ภายใต้ UV 366nm ค่า hRf 21-23, 80-83 มีสีน้ำเงิน, ค่า hRf 26-28, 41-43 มีสีส้มและค่า hRf 31-34 มีสีเหลือง

4.3.2 การตรวจสอบด้วยวิธี Gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) (1)

เครื่องมือ: GC-MS (Shimadzu)

สารละลายตัวอย่าง: เจือจางน้ำมันหอมระเหยจากเหง้ากระชายดำด้วย hexane ให้มีความเข้มข้น 3.33% โดยปริมาตร

คอลัมน์: DB-1 (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm)

อุณหภูมิของตู้อบ: 50 OC

อุณหภูมิของ injector: 200 OC

โปรแกรมอุณหภูมิของตู้อบ: แสดงใน ตารางที่ 1

ปริมาณที่ฉีด: 0.1 มคล.

การไหลของคอลัมน์: 125.8 มล./นาที

ความดัน: 69.4 kPa

Split ratio: 100:1

ตารางที่ 1 โปรแกรมอุณหภูมิของตู้อบที่ใช้ในการวิเคราะห์น้ำมันหอมระเหยจากเหง้ากระชายดำ (1)

การวิเคราะห์ด้วยวิธี High-performance liquid chromatography (HPLC)

เตรียมสารสกัดเมทานอลโดยนำผงแห้งของเหง้ากระชายดำ 2 ก. มาเติมเมทานอล 20 มล. สกัดด้วยวิธีสกัดแบบไหลย้อนกลับ (reflux) นาน 120 นาที ทำการสกัดซ้ำ 2 ครั้ง นำสารสกัดที่ได้มาปั่นด้วยเครื่อง centrifuge ความเร็ว 3,000 รอบ/นาที นาน 5 นาที นำส่วนใสมารวมกันและปรับปริมาตรเป็น 100 มล. ด้วยเมทานอล นำสารสกัดที่ได้ 1 มล. ใส่ลงในvolumetric flask ขนาด 5-มล. ปรับปริมาตรด้วยเมทานอลนำสารที่ได้ไปตรวจสอบสารในกลุ่ม methoxyflavones ด้วยวิธี HPLC ซึ่งมีสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (11)

Column: Inertsil ODS-3 column (3 มคม.;100 × 2.1 มม.) อุณหภูมิ column 40 OC

Mobile phase: methanol (A) และ 0.1% acetic acid ในน้ำ (B); gradient program: ที่เวลา 0นาที A/B = 25:75 v/v, ที่เวลา 5–45 นาที A/B = 63:37 v/v, ที่เวลา 45–60 นาที A/B = 25:75 v/v

Flow rate: 0.2 มล./นาที

Injection volumes: 2 มคล.

Detector: UV–Vis detectorที่ความยาวคลื่น 330 นาโนเมตร

Reference standard: สารในกลุ่ม methoxyflavones จำนวน 12 ชนิด ได้แก่ 5-hydroxy-7-methoxyflavone, 5,7-dimethoxyflavone, 5-hydroxy-7,4′-dimethoxyflavone, 5,7,4′-trimethoxyflavone, 5-hydroxy-7,3′,4′-trimethoxyflavone, 5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone, 3,5,7-trimethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone, 3,5,7,4′-tetramethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone, 3,5,7,3′,4′-pentamethoxyflavone

การวิเคราะห์สาร 5,7-dimethoxyflavone และ 5,7,4́́́′trimethoxyflavone ด้วยวิธี HPLC มีสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (21)

Column: BDS C18 (5 มคม.; 4.6 มม. x 150 มม.) อุณหภูมิ column 40 OC

Mobile phase: methyl alcohol : 0.2% acetic acid อัตราส่วน 58 : 42 โดยปริมาตร

Flow rate: 1.5 มล./นาที

Injection volume: 20 มคล.

Detector: Photodiode array; scan ที่ความยาวคลื่น 210–350 นาโนเมตร และ detection ที่ความยาวคลื่น 310 นาโนเมตร

Run time: 10 นาที

ยังไม่มีการรายงานการศึกษาทางคลินิกสำหรับการใช้ประโยชน์ทางด้านเครื่องสำอางของกระชายดำ

1 การศึกษาเกี่ยวกับเส้นผมและหนังศีรษะ

1.1 ยับยั้งการหลุดร่วงของเส้นผม (H004)

การศึกษาฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ 5α-reductase ของสารสกัด 70% เมทานอลของเหง้ากระชายดำจากประเทศญี่ปุ่น (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งสกัดด้วยวิธีสกัดแบบไหลย้อนกลับ (reflux) ใน 70% เมทานอล นาน 30 นาที กรองสารสกัดที่ได้ นำส่วนกากไปสกัดด้วยวิธีเดียวกันอีกครั้ง กรองสารสกัดที่ได้ นำสารสกัดทั้ง 2 ครั้งมารวมกัน ทำให้เข้มข้นด้วยการลดความดัน แล้วนำมาทำให้แห้งด้วยความเย็น (lyophilize) นำสารสกัดที่ได้มาแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟฟีได้สารกลุ่มฟลาโวนอยด์ได้แก่ 3,5,7,3′,4′-pentamethoxyflavone, 5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone, 3,5,7-trimethoxyflavone, 5,7-dimethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone, 3,5,7,4′-tetramethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone, 5,7,4′-trimehoxyflavone, และ 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone จากนั้นนำสารสกัดและสารสำคัญที่แยกได้ไปทดสอบด้วยวิธี 5α-reductase inhibition assay พบว่าสารสกัดขนาด 100, 200, และ 500 มคก./มล. สามารถยับยั้งเอนไซม์ได้ 44.1, 62.5, และ 75.8% ตามลำดับ ส่วน สาร 3,5,7,3′,4′-pentamethoxyflavone, 5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone, 3,5,7-trimethoxyflavone, 5,7-dimethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone, 3,5,7,4′-tetramethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone, 5,7,4′-trimehoxyflavone, และ 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone ในขนาด 50 ไมโครโมลาร์ สามารถยับยั้งเอนไซม์ได้55.9, 55.9, 34.9, 31.3, 26.1, 23.5, 18.7, 13.3, และ 11.2% ตามลำดับในขณะที่ยามาตรฐาน finasteride ขนาด 250 นาโนโมลาร์ สามารถยับยั้งได้ 53.7% จะเห็นว่า 3,5,7,3′,4′-pentamethoxyflavone และ5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone ออกฤทธิ์ดีที่สุด ซึ่งฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ 5α-reductase อาจมีส่วนช่วยในการลดการหลุดร่วงของเส้นผมได้ (5)

2 การศึกษาเกี่ยวกับผิวหน้า

2.1 ต้านสิวบนใบหน้า (F006)

การทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อก่อสิวของสารสกัด 95% เอทานอลของเหง้ากระชายดำจากแหล่งปลูกในจังหวัดกรุงเทพมหานคร (ไม่ระบุ voucher specimen)  และผลิตสารสกัดโดยบริษัท Biocm Co., Ltd. ประเทศเกาหลี โดยการแช่ผงกระชายดำแห้งใน 95% เอทานอล ที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลานาน 24 ชม. จากนั้นนำมากรอง และทำให้เข้มข้นโดยการลดความดันด้วยเครี่อง rotary evaporator และทำการทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียก่อสิว 2 ชนิดคือ Propionibacterium acnes (KCTC 3314) และStaphylococcus aureus subsp. aureus (KCTC 1927) พบว่า สารสกัดความเข้มข้น 250 และ 500 มคก./มล. สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของ P. acnes และ S. aureusได้เกือบสมบูรณ์ตามลำดับ (8)

การทดสอบฤทธิ์ลดการสร้างน้ำมันส่วนเกินจากต่อมไขมัน (sebostatic) โดยทำการทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้างไตรกลีเซอไรด์ ซึ่งเป็นส่วนประกอบหลักของซีบัม (sebum) และทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสะสมไขมัน (lipid accumulation) ในเซลล์ต่อมไขมันซีโบไซต์ (sebocyte) ซึ่งถูกเหนี่ยวด้วย insulin-like growth factor (IGF-1) และ linoleic acid (LA) โดยใช้สารสกัดขนาด 1, 2.5, และ 5 มคก./มล. พบว่าสารสกัดทุกขนาดทำให้ระดับไตรกลีเซอไรด์ในเซลล์ลดลง และสารสกัดขนาด 5 มคก./มล. ทำให้การสะสมไขมันภายในเซลล์ลดลงอย่างชัดเจน ซึ่งผลการทดลองดังกล่าวได้รับการยืนยันจากการลดลงของการแสดงออกของ peroxisome proliferation-activating receptors (PPAR-γ) และการติดสีย้อมที่จางลงในการทดสอบย้อมสีหยดไขมัน (oil red O staining) ของเซลล์ซีโบไซต์ แสดงให้เห็นว่า สารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำสามารถลดการสร้างน้ำมันส่วนเกินจากต่อมไขมันได้ (8)

3 การศึกษาเกี่ยวกับผิวกาย

3.1 ทำให้ผิวขาว (ลดการสร้างเม็ดสีของผิวหนัง) (S001)

การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการเกิดเม็ดสี (melanogenesis) ของสารสกัดเมทานอลของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดเลย (voucher specimen: 2008.05. Raj-03) ซึ่งสกัดโดยการนำเหง้ากระชายดำแห้งมาสับให้ละเอียด สกัดด้วยวิธีสกัดแบบไหลย้อนกลับ กับเมทานอล 4 ครั้ง ครั้งละ 4 ชม. รวมสารสกัดที่ได้ทั้งหมด ทำให้เข้มข้นโดยการลดความดัน นำไปสกัดแยกชั้น (partition) ด้วย EtOAc–H2O (1:1, v/v) ซึ่งจะได้ส่วนสกัดเอทิลอะซิเตท (EtOAc-soluble fraction) จากนั้นนำส่วนของน้ำมาผ่าน Diaion HP-20 column chromatography และชะด้วยน้ำและเมทานอลตามลำดับ ซึ่งจะได้ส่วนสกัดน้ำ (H2O eluted fraction) และส่วนสกัดเมทานอล (MeOH-eluted fraction) จากนั้นนำสารสกัดและส่วนสกัดต่างๆ มาทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการเกิดเม็ดสีในเซลล์มะเร็งเม็ดสีผิวของหนูเม้าส์ชนิด B16 melanoma 4A5 ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย theophylline พบว่า สารสกัดเมทานอลและส่วนสกัดเอทิลอะซิเตทมีค่าความเข้มข้นที่สามารถยับยั้งการเกิดเม็ดสีได้ครึ่งหนึ่ง (IC50) เท่ากับ 9.6 และ 4.9 มคก./มล. ตามลำดับ ในขณะที่ส่วนสกัดเมทานอลและส่วนสกัดน้ำแสดงฤทธิ์ได้ไม่ดีนัก โดยที่ขนาด 30 มคก./มล. สามารถยับยั้งการเกิดเม็ดสีได้ 37.9 และ -7.1% ตามลำดับ จากนั้นจึงนำส่วนสกัดเอทิลอะซิเตทและส่วนสกัดเมทานอลมาแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟฟี และพิสูจน์โครงสร้างสารด้วยเทคนิค specific rotations, CD spectra, UV spectra, IR spectra, FAB-MS และ high resolution MS, 1H-NMR spectra, และ13C-NMR spectra นำสารสำคัญที่ได้มาทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการเกิดเม็ดสีอีกครั้ง ซึ่งพบว่ามีสาร 4 ชนิด ที่ออกฤทธิ์ยับยั้งการเกิดเม็ดสีได้ดี ได้แก่ 5-hydroxy-7,3′,4′-trimethoxyflavone, 5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone,5,3′-dihydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavone, และ 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone โดยมีค่า IC50เท่ากับ 8.8, 8.6, 2.9, และ 3.5 ไมโครโมลาร์ตามลำดับ และมีประสิทธิภาพดีกว่าสารยับยั้งการเกิดเม็ดสีมาตรฐาน arbutin ซึ่งมีค่า IC50 เท่ากับ 174 ไมโครโมลาร์ นอกจากนี้ การทดสอบกับ mushroom tyrosinase (ใช้ L-tyrosine และ L-DOPA เป็น substrate) และเซลล์มะเร็งเม็ดสีผิวของหนูเม้าส์ชนิด B16 melanoma 4A5 ยังพบว่า สารทั้ง 4 ชนิด มีฤทธิ์ยับยั้งการแสดงออกของเอนไซม์ tyrosinase, tyrosine-related protein (TRP)-1, และ TRP-2 mRNA ซึ่งมีความเกี่ยวข้องกับกลไกในการเกิดเม็ดสีด้วย แต่ประสิทธิภาพยังน้อยกว่าสารยับยั้งการเกิดเม็ดสีมาตรฐาน kojic acidโดยสารทั้ง 4 ชนิดที่ความเข้มข้นสูงสุด (100 ไมโครโมลาร์) สามารถยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ tyrosinase ได้น้อยกว่า 23% (ทั้งL-tyrosine และ L-DOPA) ในขณะที่สาร kojic acid มีค่า IC50 เท่ากับ 43.6 และ 29.6 ไมโครโมลาร์ เมื่อทดสอบกับL-tyrosine และ L-DOPA ตามลำดับ (6)

3.2 ต้านอนุมูลอิสระ (S006)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดเฮกเซน สารสกัดเอทานอล และสารสกัดน้ำของเหง้ากระชายดำสายพันธุ์ร่มเกล้าจากจังหวัดเลย (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งสกัดต่อเนื่องโดยใช้อุปกรณ์ Soxhlet extractor นำสารสกัดที่ได้มาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) assay พบว่าสารสกัดเฮกเซน สารสกัดเอทานอล และสารสกัดน้ำ มีค่าความเข้มข้นที่สามารถต้านอนุมูลอิสระได้ครึ่งหนึ่ง (EC50) เท่ากับ 1,182.03, 222.03, และ 1,162.79 มคก./มล. ตามลำดับ ซึ่งจะเห็นว่าสารสกัดเอทานอลมีฤทธิ์ดีที่สุด แต่ประสิทธิภาพยังต่ำกว่าวิตามินซี (22)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัด 95% เอทานอลของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดเชียงใหม่ (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งสกัดด้วยอุปกรณ์Soxhlet extractor นาน 10 ชม. พบว่าสารสกัด 95%เอทานอลของกระชายดำมีฤทธิ์ยับยั้งการเกิดการออกซิเดชันของโปรตีน(protein oxidation)จากการเหนี่ยวนำด้วย 2,2′-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) เมื่อทดสอบด้วย allophycocyanin test และมีฤทธิ์ยับยั้งการเกิดไกลเคชัน (nonenzymatic protein glycation)หรือยับยั้งการเกิดพันธะระหว่างโมเลกุลของโปรตีนกับน้ำตาลของปฏิกริยาที่ไม่ใช้เอนไซม์ โดยสารสกัด 95%เอทานอลของเหง้ากระชายดำที่ความเข้มข้น 1 และ 5 มคก./มล. ทำให้ค่าครึ่งชีวิต(half-life)ของโปรตีน allophycocyanin เพิ่มขึ้นเป็น 11.31 และ 16.73 นาที ตามลำดับ (กลุ่มควบคุมมี half-life 8.76 นาที) และที่ความเข้มข้น 50 มคก./มล. สามารถยับยั้งการเกิดผลผลิตจากการเกิดไกลเคชันหรือ advanced glycation end products (AGEs) ได้ 28.10% แสดงให้เห็นว่าสารสกัด 95% เอทานอลของเหง้ากระชายดำอาจช่วยป้องกันและชะลอการเสื่อมของโปรตีนซึ่งเกิดจากอายุที่มากขึ้นหรือภาวะของโรคเบาหวานได้ (23)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัด 95% เอทานอลของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดเชียงใหม่ (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งสกัดด้วยวิธีแช่สกัด (maceration) โดยนำผงแห้งของกระชายดำมาแช่ใน 95% เอทานอลที่อุณหภูมิห้องและป้องกันแสง เป็นเวลานาน 3 วัน โดยทำ 3 รอบ รวมสารสกัดทั้งหมด นำมากรอง และระเหยแห้งภายใต้สภาวะสุญญากาศ ที่อุณหภูมิ 45 OC จากนั้นนำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี 2,2′-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) free radicals decolorization assay พบว่าสารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำมีค่าความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระได้เทียบเท่ากับสารต้านอนุมูลอิสระมาตรฐาน trolox  (trolox equivalent antioxidant capacity; TEAC) เท่ากับ 21.21 มก. trolox /สารสกัดแห้ง 1 ก. และการทดสอบด้วยวิธี thiobarbituric acid-reactive substance (TBARS) assay พบว่าสารสกัดขนาด 1 มคก./มล. สามารถยับยั้งmalonaldehyde (MDA) ได้ 4.08±0.05 ไมโครโมลาร์ (24)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดเมทานอลของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดเลย (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งสกัดด้วยวิธีแช่สกัดโดยนำเหง้ากระชายดำสดมาแช่ในเมทานอลที่อุณหภูมิ 30±2 OC เป็นเวลานาน 3-4 วัน นำมากรอง และระเหยแห้งโดยการลดความดัน จากนั้นนำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay พบว่าสารสกัดเมทานอลของกระชายดำมีค่าความเข้มข้นที่สามารถยับยั้งได้ครึ่งหนึ่ง (IC50) เท่ากับ 61.5 มคก./มล. (25)

การศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำจากจังหวัดพิษณุโลก (voucher specimen: QSBG.15194) ซึ่งได้จากการสกัดด้วย 95% เอทานอล และระเหยตัวทำละลายที่อุณหภูมิ 55 OC จากนั้นจึงทำให้แห้งด้วยความเย็น (lyophilize) โดยทำการทดสอบกับหลอดเลือด aortic ring ของหนูแรท พบว่าสารสกัดที่ความเข้มข้น 1-1,000พิโคกรัม./มล. สามารถยับยั้งการเกิด superoxide radical (O2∙-) จากการเหนี่ยวนำด้วย xanthine ขนาด 10 ไมโครโมลาร์ หรือ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) ขนาด 100ไมโครโมลาร์ได้ และสารสกัดที่ความเข้มข้น 1-100มคก./มล. สามารถยับยั้งการเกิดภาวะเครียดออกซิเดชัน (oxidative stress) จากการเหนี่ยวนำด้วย pyrogallol ขนาด 30ไมโครโมลาร์ ได้ โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้ (26)

การศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัด 95% เอทานอลของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดพิษณุโลก (voucher specimen: QSBG.15194) ซึ่งได้จากการสกัดด้วย 95% เอทานอล และระเหยตัวทำละลายที่อุณหภูมิ 55 OC จากนั้นจึงทำให้แห้งด้วยความเย็น นำไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay พบว่าสารสกัด 95% เอทานอล มีค่าIC50 เท่ากับ 161.9±5.9 มคก./มล. ในขณะที่สารมาตรฐาน ascorbic acid มีค่า IC50เท่ากับ 50±5.6 มคก./มล. (27)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัด 80% เอทานอลของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดสมุทรปราการ (ไม่ระบุ voucherspecimen) ซึ่งสกัดด้วยการนำผงกระชายดำ 1 ก. มาผสมกับ 80% เอทานอล 25 มล. นำส่วนที่ละลาย มาสกัดต่อกับน้ำร้อนอุณหภูมิ 80 OC โดยใช้ reflux condenser (ไม่ระบุระยะเวลา) นำสารสกัดที่ได้มากรอง และทำให้เข้มข้นด้วยระบบสุญญากาศ จากนั้นนำมาละลายในน้ำกลั่น 5 มล. และนำไปทำให้แห้งด้วยการแช่เยือกแข็ง (freeze dry) นำไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี ABTS assay, DPPH assay, และoxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay พบว่าสารสกัด 80% เอทานอลของกระชายดำขนาด 12.5, 25, 50, 100, 200, และ 400 มคก./มล.สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ในทุกการทดสอบ โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้ การวิเคราะห์ทางเคมีพบว่าสารสกัด 80% เอทานอลของกระชายดำมีสาร gallic acid, apigenin, และ tangeretin ซึ่งเป็นสารในกลุ่ม polyphenolเป็นส่วนประกอบหลัก ซึ่งสารดังกล่าวมีรายงานว่ามีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ดี (4)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัด 95% เอทานอลของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดเชียงใหม่ (voucher specimen: TS2015-22) ซึ่งทำการสกัดผงเหง้ากระชายดำแห้งด้วยการใช้คลื่นเสียงความถี่สูง (sonicate) ใน 95% เอทานอลที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลานาน 30 นาที นำมากรองและทำให้เข้มข้นโดยการระเหยตัวทำละลายโดยการลดความดันจากนั้นนำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี ABTS assay, DPPH assay, และferric reducing antioxidant power (FRAP) assay พบว่ามีค่าการต้านอนุมูลอิสระเทียบเท่ากับสารต้านอนุมูลอิสระมาตรฐาน trolox ขนาด 369.21, 91.73, และ155.41ไมโครโมล tolox/นน.สารสกัดแห้ง 1 ก. ตามลำดับ (7)

3.3 ทำให้ผิวอ่อนเยาว์ (S007)

การศึกษาฤทธิ์ชะลอวัยของผิวของสารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำจากจังหวัดกรุงเทพมหานคร (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งสกัดโดยการนำผงแห้งของกระชายดำมาเขย่ากับ 95% เอทานอลที่อุณหภูมิ 60 OC ในอ่างควบคุมอุณหภูมิ(water bath)นาน 3 ชม. จากนั้นนำมาทำให้เข้มข้นด้วยเครื่อง rotary evaporator (สารสำคัญที่พบคือ 5,7-dimethoxyflavone ซึ่งมีอยู่ 14.1%w/w) เมื่อนำสารสกัดที่ได้มาทดสอบกับเซลล์ผิวหนังของมนุษย์ (human dermal fibroblast) ชนิด Hs68ที่ถูกเหนี่ยวนำให้เกิดภาวะเซลล์แก่ (cellular senescence) และการทำงานของไมโตคอนเดรียผิดปกติ (mitochondrial dysfunction) ด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) โดยใช้สารสกัดขนาด 1, 5, และ 10 มคก./มล. พบว่าสารสกัดเอทานอลของกระชายดำสามารถเพิ่มการเจริญเติบโตของเซลล์และยับยั้งความชรา (senescence) ที่เกิดร่วมกับการกระตุ้นเอนไซม์β-galactosidase ได้มีผลยับยั้งการแสดงออกของ cell-cycle inhibitors (p53, p21, p16, pRb) มีผลกระตุ้นการแสดงออกของ cell-cycle activators (E2F1 และ E2F2) มีผลยับยั้งการกระตุ้น phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (AKT) signaling pathway จากการเหนี่ยวนำด้วย H2O2ผ่านการควบคุมการแสดงออกของ forkhead box O3a (FoxO3a) และ mammalian target of rapamycin (mTOR) มีผลยับยั้งสารก่อการอักเสบ ได้แก่ interleukin-6 (IL-6), IL-8, nuclear factor kappa B (NF-κB), cyclooxygenase-2 (COX-2) และมีผลเพิ่มการแสดงออกของ PGC-1α, ERRα, NRF1, Tfam ซึ่งมีความเกี่ยวข้องกับกระบวนการ biogenesis และการทำงานของ mitochondrial นอกจากนี้ สารสกัดเอทานอลของกระชายดำยังยับยั้งการลดลงของระดับ ATP และยับยั้งการเพิ่มระดับของreactive oxygen species (ROS) โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้ การทดสอบในหนูเม้าส์ไร้ขน (hairless) เพศเมีย อายุ 8 สัปดาห์ (middle-aged) โดยป้อนหนูด้วยสารสกัดขนาด 200 มก./กก./วัน นาน 24 สัปดาห์ หลังสิ้นสุดการทดลอง ทำการเปรียบเทียบผลกับหนูอายุ 8 สัปดาห์ พบว่า สารสกัดเอทานอลของกระชายดำสามารถยับยั้งการเกิดรอยเหี่ยวย่น (wrinkle formation) ภาวะที่ชั้นผิวหนังบาง (skin atrophy) และการสูญเสียความยืดหยุ่นของผิวหนัง (loss of elasticity) ด้วยการเพิ่ม collagen และ elastic fibers ให้กับผิวหนัง จากผลการทดลองทั้งหมดแสดงให้เห็นว่า สารสกัดเอทานอลของกระชายดำสามารถป้องกันกระบวนการแก่จากความชรา (intrinsic aging process) ในสัตว์ทดลองได้ โดยกลไกการออกฤทธิ์น่าจะเกี่ยวข้องกับการยับยั้งภาวะเซลล์แก่และป้องกันการทำงานที่ผิดปกติของไมโตคอนเดรีย (28)

3.4 กันแดดสำหรับผิวกาย (S008)

การศึกษาฤทธิ์ปกป้องรังสีอัลตราไวโอเลต (ultraviolet; UV) ในหนูเม้าส์ไร้ขน (hairless) ของสารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำจากจังหวัดกรุงเทพมหานคร (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งสกัดด้วยการแช่ผงแห้งของกระชายดำใน 95% เอทานอลที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลานาน 24 ชม. กรอง และทำให้เข้มข้นโดยการลดความดันด้วยเครื่อง rotary evaporator โดยหนูเพศเมียจำนวน 20 ตัวจะถูกสุ่มแยกเป็น 4 กลุ่ม กลุ่มละ 5 ตัว กลุ่มที่ 1 เป็นกลุ่มควบคุม กลุ่มที่ 2 ได้รับการฉายรังสี UVB กลุ่มที่ 3 และ 4ได้รับการฉายรังสี UVB ร่วมกับการได้รับการป้อนสารสกัดขนาด 100 และ 200 มก./กก./วัน ตามลำดับ เป็นเวลานาน 13 สัปดาห์ พบว่าสารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำสามารถป้องกันการเกิดริ้วรอย (wrinkle formation) และลดการสูญเสียเส้นใยคอลลาเจน (loss of collagen fibers) รวมทั้งช่วยเพิ่มระดับ mRNA ของ COL1A1, COL3A1, และ COL7A1ซึ่งเป็นยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างคอลลาเจน types I, III, และ VII ตามลำดับซึ่งกลไกในการลดริ้วรอยของสารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำอาจเกี่ยวข้องกับการลดการแสดงออกของเอนไซม์ที่ทำหน้าที่ย่อยโปรตีนที่เป็นส่วนสำคัญสำหรับ extracellular matrix หรือ matrix metalloproteinases (MMP)-2, MMP-3, MMP-9, และ MMP-13 ผ่านการยับยั้งการทำงานของ c-Jun และ c-Fos ซึ่งเกิดจากการเหนี่ยวนำด้วยรังสี UVB และสารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำยังเพิ่มการแสดงออกของ catalase ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระในผิวหนังด้วย นอกจากนี้สารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำยังทำให้การแสดงออกของสารก่อการอักเสบ ได้แก่ NF-κB, IL-1β, และ COX-2 ลดลงอย่างชัดเจนแสดงให้เห็นว่า สารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำสามารถปกป้องผิวจากการได้รับรังสี UV ได้ (29)

การศึกษาฤทธิ์ปกป้องรังสีอัลตราไวโอเลต (ultraviolet; UV) ของสารสกัด 95% เอทานอลของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดเชียงใหม่ (voucher specimen: TS2015-22) ) ซึ่งทำการสกัดผงเหง้ากระชายดำแห้งด้วยการใช้คลื่นเสียงความถี่สูง ใน 95% เอทานอลที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลานาน 30 นาที นำมากรองและทำให้เข้มข้นโดยการระเหยตัวทำละลายโดยการลดความดัน จากนั้นนำมาแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟฟีและพิสูจน์โครงสร้างสารด้วยการเปรียบเทียบกับ spectroscopic data นำสารสกัดหยาบและสารสำคัญที่แยกได้มาทดสอบฤทธิ์ป้องกันรังสี UVA (320–400 นาโนเมตร) และ UVB (290–320 nm) ด้วยวิธี UVA/UVB Ratio โดยแบ่งระดับของการปกป้องเป็น 4 ระดับด้วย UVA star rating ดังนี้ 0 UVA Star Rating (UVA/UVB ratio <0.2) คือ ปกป้องต่ำ (lowprotection), 1 UVA Star Rating (0.21 ≤ UVA/UVB ratio <0.40) คือ ปกป้องปานกลาง (moderateprotection), 2 UVA Star Rating (0.41 ≤ UVA/UVB ratio <0.6) คือ ปกป้องสูง(high protection), 3 UVA Star Rating (0.61 ≤ UVA/UVB ratio <0.8) คือ ปกป้องเยี่ยม(superior protection), และ 4 UVAStar Rating (UVA/UVB ratio >0.8) คือ ปกป้องสูงสุด maximum protectionประเมินค่าความยาวคลื่นที่สามารถให้การป้องกันแสง UV ได้ 90 เปอร์เซนต์ (critical wavelength; λc) และคำนวณค่า sun protection factor (SPF) โดยใช้สารสกัดหยาบขนาด 20–100มคก./มล. และสารสำคัญขนาด 10–50 มคก./มล.ผลการทดสอบพบว่า สารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำมี UVA/UVB ratio 0.62 ซึ่งแสดงถึงการปกป้องระดับเยี่ยม(superior protection) มีค่าλc เท่ากับ 365 นาโนเมตร และที่ความเข้มข้น 20, 40, 60, 80, และ 100 มคก./มล. มีค่า SPF เท่ากับ 2.82, 5.83, 8.78, 11.73, และ 15.10 ตามลำดับและสารสำคัญที่แยกได้จากสารสกัด 95% เอทานอลของเหง้ากระชายดำ ได้แก่ 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone, 5-hydroxy-7-methoxyflavone, 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone, 5-hydroxy-7,4′-dimethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone, 3,5,7-trimethoxyflavone, 3,5,7,3′,4′-pentamethoxyflavone, 5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone, 5,7,4′-trimethoxyflavone, และ 3,5,7,4′-tetramethoxyflavone จากผลการทดลองทั้งหมด แสดงให้เห็นว่าสารสกัด 95% เอทานอลของเหง้ากระชายดำ และสารสำคัญที่แยกได้มีประสิทธิภาพในการป้องกันรังสี UV (7)

3.5 ต้านการอักเสบ (S014)

การศึกษาฤทธิ์ต้านการอักเสบของสาร 5,7-dimethoxyflavone ที่แยกได้จากเหง้ากระชายดำ (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) ในหนูแรท โดยการป้อนหนูด้วยสาร 5,7-dimethoxyflavone ขนาด 300 มก./นน.ตัว 1 กก. เพียงครั้งเดียว พบว่าสามารถยับยั้งการบวมของอุ้งเท้าที่เกิดจากการเหนี่ยวนำให้เกิดการอักเสบด้วยสารคาราจีนินและสารคาโอลินได้ 16.0-48.0% และ 43.7-80.9% ตามลำดับ และที่ขนาดดังกล่าวยังสามารถลดการอักเสบในช่องปอด (pleurisy) ของหนูแรทด้วย โดยคาดว่ากลไกการออกฤทธิ์อาจเกี่ยวข้องกับการยับยั้งการสร้างสารprostaglandin (9)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัด 95%เอทานอลของกระชายดำจาก 12 พื้นที่ในประเทศไทย (ไม่ระบุจังหวัดและ voucher specimen) ซึ่งสกัดด้วยวิธีแช่สกัด โดยนำผงแห้งของกระชายดำจากแหล่งต่าง ๆ มาแช่ใน 95%เอทานอล ซ้ำ 2 วัน จากนั้นนำมากรองและทำให้แห้ง แล้วนำมาทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ xanthine oxidase ด้วยวิธีxanthine oxidase assay เปรียบเทียบผลกับยาต้านการอักเสบมาตรฐาน allopurinol พบว่าสารสกัดขนาด 1 มก. ออกฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ xanthineoxidase ได้เทียบเท่ากับยา allopurinol ขนาด 0.298–6.336 มคก. โดยค่าIC50ของยา allopurinol เท่ากับ 6.56±0.48 มคก./มล.การศึกษาด้วย COX-2 assay เพื่อทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ COX-2 พบว่าสารสกัดดังกล่าวในขนาด 0.75 และ 1.50 มก./มล. มีฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ COX-2 ได้ 3.73–88.07% และ 29.27–91.02% ตามลำดับ แสดงให้เห็นว่ากลไกการออกฤทธิ์ต้านการอักเสบของกระชายดำอาจมีความเกี่ยวข้องกับ xanthine และ arachidonic pathway โดยกระชายดำจากแต่ละพื้นที่ มีประสิทธิภาพไม่เท่ากัน (30)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดเอทานอลและสารสกัดน้ำของเหง้ากระชายดำที่ได้จากร้านขายยาแผนโบราณในจังหวัดสงขลา (voucher specimen: SKP2061116) ซึ่งสกัดโดยการนำผงแห้งของกระชายดำมาสกัดด้วยวิธี reflex กับตัวทำละลายทั้ง 2 ชนิด เป็นเวลานาน 3 ชม. จากนั้นจึงกำจัดตัวทำละลายโดยการลดความดัน เมื่อนำไปทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการหลั่ง nitric oxide (NO) จากเซลล์แมคโครฟาจชนิด RAW264.7 ที่ถูกกระตุ้นด้วย lipopolysaccharide (LPS) พบว่าสารสกัดเอทานอลและสารสกัดน้ำของกระชายดำมีค่าIC50เท่ากับ 7.8 และ 48.2 มคก./มล. ตามลำดับ จึงนำเฉพาะสารสกัดเอทานอลมาสกัดแยกส่วนด้วยตัวทำละลาย เฮกเซน คลอโรฟอร์มเอทิลอะซิเตทและน้ำ เมื่อนำส่วนของสารสกัดดังกล่าวมาทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการหลั่ง nitric oxide พบว่ามีค่า IC50เท่ากับ 3.6, 8.8, >100, และ >100มคก./มล. ตามลำดับ (10) จากนั้นจึงนำส่วนสกัดเฮกเซนมาแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟฟี พิสูจน์และเปรียบเทียบโครงสร้างสารด้วย 1H and 13C NMR spectral ซึ่งจะได้สารสำคัญ 7 ชนิด ได้แก่ 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone, 5-hydroxy-7-methoxyflavone, 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone, 5-hydroxy-7,4′-dimethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone, 3,5,7-trimethoxyflavone, และ 3,5,7,4′-tetramethoxyflavone เมื่อนำไปทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้าง NO จากเซลล์แมคโครฟาจชนิด RAW264.7 ที่ถูกกระตุ้นด้วย LPS พบว่าสารสำคัญทั้งหมดมีค่า IC50เท่ากับ 41.6, 64.3, 30.6, 24.5, 16.1, 88.5, และ >100 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับในขณะที่สารต้านการอักเสบมาตรฐาน L-nitroarginine (L-NA) และ caffeic acid phenethylester (CAPE) มีค่า IC50เท่ากับ 61.8 และ 5.6 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับซึ่งจะเห็นว่าสาร 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone แสดงฤทธิ์ยับยั้งการสร้าง NO ได้ดีที่สุด (IC50เท่ากับ 16.1 ไมโครโมลาร์) รองลงมาคือ 5-hydroxy-7,4′-dimethoxyflavone และ 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone (IC50เท่ากับ 24.5 และ 30.6 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ)การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้างPGE2 และ TNF-αจากการเหนี่ยวนำด้วย LPSในเซลล์ macrophage ชนิด RAW264.7 ของสารสกัดเอทานอล ขนาด 3-100 มคก./มล.และ 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone ขนาด 3-100 ไมโครโมลาร์พบว่าสารสกัดเอทานอล และ 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone มีฤทธิ์ยับยั้งการสร้าง PGE2โดยมีค่า IC50เท่ากับ 9.2 มคก./มล.และ 16.3 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ แต่ยับยั้งการสร้าง TNF-αได้เล็กน้อย โดยมีค่า IC50>100 ไมโครโมลาร์ จากผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า สาร 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone เป็นสารออกฤทธิ์ต้านการอักเสบในกระชายดำ ซึ่งกลไกการออกฤทธิ์น่าจะเกี่ยวข้องกับการยับยั้งการสร้าง NO และ PGE2 (10, 11, 12)

การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการแสดงออกของinducible nitric oxide synthase (iNOS) และ COX-2 mRNA ในเซลล์ macrophage ชนิด RAW264.7 ของสารสกัดเอทานอลขนาด 3-100 มคก./มล. และสาร 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone ขนาด 3-100 ไมโครโมลาร์โดยเปรียบเทียบกับยาต้านการอักเสบมาตรฐาน indomethacin พบว่าสารสกัดเอทานอลและสาร 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone ทำให้ระดับ iNOSmRNA ภายในเซลล์ลดลง แต่มีผลยับยั้งการแสดงออกของ COX-2 mRNA เพียงบางส่วน (partly affect) เช่นเดียวกับยา indomethacinซึ่งออกฤทธิ์ยับยั้งการแสดงออกของ iNOS โดยประสิทธิภาพขึ้นกับขนาดที่ให้และมีผลต่อการแสดงออกของ COX-2 mRNA เพียงเล็กน้อย และการทดสอบฤทธิ์ต้านการบวมบริเวณอุ้งเท้าของหนูแรทที่ถูกเหนี่ยวนำด้วยสารคาราจีแนน โดยใช้สารสกัดเอทานอล, ส่วนสกัดเฮกเซน, ส่วนสกัดคลอโรฟอร์ม, ส่วนสกัดเอทิลอะซิเตท, และส่วนสกัดน้ำป้อนหนูในขนาด 150 มก./กก. เปรียบเทียบกับยาต้านการอักเสบมาตรฐาน indomethacin 10 มก./กก. พบว่าส่วนสกัดคลอโรฟอร์ม และส่วนสกัดเฮกเซน สามารถลดการบวมที่อุ้งเท้าของหนูได้ที่เวลา 3 และ 5 ชม. หลังการฉีดสารคาราจีแนน และลดการบวมได้ 25.4 และ 25.3% ตามลำดับ ส่วนสารสกัดเอทานอลส่วนสกัดเอทิลอะซิเตทและส่วนสกัดน้ำ มีฤทธิ์ค่อนข้างต่ำ โดยสามารถลดการบวมที่อุ้งเท้าของหนูได้ที่เวลา 3 ชม. หลังการฉีดสารคาราจีแนน และลดการบวมได้ 12.9, 5.6, และ 6.2% ตามลำดับ ในขณะที่ยาindomethacin สามารถลดการบวมที่อุ้งเท้าของหนูได้ที่เวลา 3 ชม. หลังการฉีดสารคาราจีแนน และลดการบวมได้ 18.3% จากผลการทดลองทั้งหมดแสดงให้เห็นว่า สารสกัดเอทานอล ส่วนสกัดต่าง ๆ และสาร 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone ของกระชายดำมีฤทธิ์ต้านการอักเสบ โดยกลไกการออกฤทธิ์อาจเกี่ยวข้องกับฤทธิ์ยับยั้งการสร้าง PGE2 และฤทธิ์ยับยั้งการแสดงออกของ iNOS (11) นอกจากนี้การแยกสกัดคลอโรฟอร์มด้วยด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟฟี และเปรียบเทียบโครงสร้างสารด้วย 1H และ13CNMR spectralพบว่าสามารถแยกสารสำคัญจากส่วนสกัดคลอโรฟอร์มได้ 12 ชนิด ได้แก่ techtochrysin, 5,7-dimethoxyflavone, 7,4′-dimethylapigenin, trimethylapigenin, tetramethylluteolin, 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone, 3,5,7-trimethoxyflavone, 3,7,4′-trimethylkaempferol, tetramethylkaempferol, ayanin, retusine, และ pentamethylquercetin จากนั้นนำสารที่แยกได้มาทดสอบฤทธิ์ยับยั้งสร้าง NO และ TNF-α จากการเหนี่ยวนำด้วย LPS ในเซลล์ macrophage ชนิด RAW264.7 รวมทั้งศึกษาผลต่อการแสดงออกของ iNOS และการเกิด phosphorylation ของ extracellular signal-regulated kinase (p-ERK) และ c-Jun N-terminal kinase (p-JNK) พบว่ามีสารออกฤทธิ์ต้านการอักเสบได้ดีจำนวน 3 ชนิด ได้แก่ 5,7-dimethoxyflavone, trimethylapigenin, และ tetramethylluteolin ซึ่งสามารถแสดงฤทธิ์ยับยั้งสร้าง NO ได้ดี โดยมีค่า IC50เท่ากับ 5.1, 4.6, และ 8.7 มคก./มล. ตามลำดับ ในขณะที่สารต้านการอักเสบมาตรฐาน parthenolideและ caffeic acid phenethyl ester (CAPE) มีค่า IC50เท่ากับ 0.31 และ 0.92มคก./มล. ตามลำดับและสารทั้ง 3 ชนิดมีฤทธิ์ยับยั้งการสร้าง TNF-αในระดับปานกลาง โดยมีค่า IC50เท่ากับ >30, 64, และ 100 มคก./มล. ตามลำดับ ในขณะที่ parthenolide และ CAPE มีค่า IC50เท่ากับ 1.6 และ 21 มคก./มล. ตามลำดับ นอกจากนี้สารทั้ง 3 ชนิด (ขนาดที่ทดสอบคือ 3, 10, และ 30 มคก./มล.) ยังยับยั้งการแสดงออกของ iNOS mRNA และ iNOS protein ได้ดี โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้ แต่ไม่มีผลยับยั้งการแสดงออกของ p-ERK หรือ p-JNK protein โดยสารที่ออกฤทธิ์ได้ดีที่สุดคือสาร trimethylapigenin ซึ่งถูกนำมาทดสอบผลต่อprotein kinases ที่เกี่ยวข้องกับการแสดงออกของ iNOSด้วยวิธีSelectScreen® Kinase Profiling Service with Z′-LYTE® and Adapta® assay พบว่าสาร trimethylapigenin ไม่มีผลยับยั้งการทำงานของ inhibitor of κB kinases หรือ mitogen-activated protein kinases (MAPK) แต่มีผลยับยั้ง spleen tyrosine kinase (SYK) แสดงให้เห็นว่าสารสำคัญจากส่วนสกัดคลอโรฟอร์มโดยเฉพาะสาร trimethylapigenin มีฤทธิ์ต้านการอักเสบ โดยมีกลไกการออกฤทธิ์เกี่ยวข้องกับการยับยั้งการแสดงออกของ iNOS และ SYK (13)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัด 50% เอทานอล สารสกัดเฮกเซน และสารสำคัญที่แยกได้สารสกัดเฮกเซนของเหง้ากระชายดำจากประเทศญี่ปุ่น (ไม่ระบุ voucher specimen) เตรียมสารสกัดโดยการนำเหง้าสดของกระชายดำมาปั่นให้ละเอียดแล้วแช่ใน 50% เอทานอล และส่วนผสมของ hexane : phosphate-buffered saline (PBS) อัตราส่วน 1:1 เขย่าด้วยเครื่องเขย่า (shaker) ที่อุณหภูมิห้อง นาน 1 คืน จากนั้นนำสารสกัดที่ได้มาปั่นด้วยเครื่องหมุนเหวี่ยง (centrifuge) ด้วยแรง 10,000 × g นาน 5 นาที เก็บส่วนที่ใส และนำมากรองผ่านเมมเบรนที่มีรูขนาด 0.2 มคม. นำมาทำให้แห้งด้วยก๊าซไนโตรเจน และนำมาวิเคราะห์สาร 5,7- dimethoxyflavone (DMF) และ 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone (TMF) ด้วย gas chromatography-mass spectrometry (GC–MS) และ liquid chromatography-mass spectrometry (LC–MS) และทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบด้วยวิธี β-hexosaminidase assay ในเซลล์ basophilic leukemia ชนิด RBL-2H3 พบว่าสารสกัด 50% เอทานอล และสารสกัดเฮกเซน ขนาด 250 มคก./มล. สามารถลดการหลั่ง β-hexosaminidase จากเซลล์ได้ 44.3±0.52% และ 45.5±3.2% ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ถึงฤทธิ์ยับยั้งกระบวนการ degranulation ของเซลล์ เมื่อนำสารสกัดเฮกเซนไปทดสอบเพิ่มเติมในเซลล์ RBL-2H3 ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วยสาร antigen และ calcium ionophore (ไม่ได้นำสารสกัดเอทานอลมาทดสอบ) พบว่าสารสกัดเฮกเซนขนาด 500 มคก./มล. สามารถยับยั้งการหลั่ง β-hexosaminidase จากการกระตุ้นด้วย antigen ได้ดีกว่า calcium ionophore (การหลั่ง β-hexosaminidase จาก RBL-2H3 เท่ากับ 32.9±5.6% และ 74.8±10.2% ตามลำดับ) การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการหลั่ง β-hexosaminidase จากการเหนี่ยวนำด้วยสาร antigen ของDMF และ TMF พบว่ามีค่า IC50เท่ากับ 19.2 และ 1.8 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ แสดงว่า TMF ออกฤทธิ์ได้ดีกว่า DMF ส่วนสารต้านการอักเสบมาตรฐาน nobiletin มีค่า IC50เท่ากับ 195 ไมโครโมลาร์ ในขณะที่การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการหลั่ง β-hexosaminidase จากการเหนี่ยวนำด้วยสารcalcium ionophore พบว่า DMF ออกฤทธิ์ได้ดีกว่า TMF โดย DMF มีค่า IC50เท่ากับ 41.3 ไมโครโมลาร์ส่วนTMF และ nobiletin ที่ขนาดสูงสุด ลดการหลั่ง β-hexosaminidase ได้น้อยกว่า 50% การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้างสารก่อการอักเสบชนิด TNF-α,IL-4, และ monocyte chemotactic protein (MCP)-1 ในเซลล์ RBL-2H3 ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย antigen พบว่าสารสกัด 50% เอทานอลขนาด 250 มคก./มล. สามารถยับยั้งการสร้าง TNF-α, IL-4, และ MCP-1 ได้ 95%, 84%, และ 67% ตามลำดับสารสกัดเฮกเซนขนาด 250 มคก./มล.สามารถยับยั้งการสร้าง TNF-α, IL-4, และ MCP-1 ได้ 96%, 92%, และ 78% ตามลำดับ สาร DMF ขนาด 50 ไมโครโมลาร์ สามารถยับยั้งการสร้าง TNF-α ได้ 100% และสามารถยับยั้งการสร้าง IL-4 และ MCP-1 ได้ 90% เช่นเดียวกับสาร TMF ขนาด 50 ไมโครโมลาร์ ซึ่งสามารถยับยั้งการสร้าง TNF-α ได้ 100% และสามารถยับยั้งการสร้าง IL-4 และ MCP-1 ได้ 90% ส่วน nobiletin ขนาด 50 ไมโครโมลาร์ สามารถยับยั้งการสร้าง TNF-α, IL-4, และ MCP-1 ได้ 70%, 83% และ 74% ตามลำดับ การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้างสารก่อการอักเสบชนิด TNF-α, IL-4, และ MCP-1 ในเซลล์ RBL-2H3 ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย calcium ionophoreพบว่าสารสกัด 50% เอทานอลขนาด 250 มคก./มล. สามารถยับยั้งการสร้าง TNF-α, IL-4, และ MCP-1 ได้ 49%, 34%, และ 42% ตามลำดับ สารสกัดเฮกเซนขนาด 250 มคก./มล. สามารถยับยั้งการสร้าง TNF-α ได้ 22% แต่ไม่มีผลต่อการสร้าง IL-4 และ MCP-1 ส่วนสาร DMF, TMF, และ nobiletin ขนาด 50 ไมโครโมลาร์ สามารถยับยั้งการสร้าง TNF-α ได้ 54%, 77% และ 49% ตามลำดับ ยับยั้งการสร้าง IL-4 ได้ 96%, 75%, และ 80% ตามลำดับ ยับยั้งการสร้าง MCP-1 ได้89%, 75%, และ 84% ตามลำดับ จากผลการทดลองทั้งหมดแสดงให้เห็นว่า สารสกัด 50% เอทานอล, สารสกัดเฮกเซน,สาร DMF และสารTMF จากกระชายดำมีฤทธิ์ต้านการอักเสบ โดยกลไกการออกฤทธิ์อาจเกี่ยวข้องกับการเข้าจับ IgE receptor มากกกว่าการออกฤทธิ์ต่อการหลั่ง calcium ภายในเซลล์ และการกระตุ้น protein kinase C (14)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบในหนูเม้าส์ของสารสกัดน้ำ-แอลกอฮอล์ (aqueous alcohol) ของเหง้ากระชายดำ (ไม่ระบุแหล่งที่มา,voucher specimen, และวิธีสกัด) โดยแบ่งหนูเป็น 2 กลุ่ม กลุ่มละ 15 ตัว กลุ่มที่ 1 ป้อนหนูด้วยสารสกัดน้ำ-แอลกอฮอล์ขนาด 45 มก./กก./วัน กลุ่มที่ 2 เป็นกลุ่มควบคุมถูกป้อนด้วยตัวทำละลายที่ใช้สกัดในขนาดที่เท่ากัน ทำการทดสอบนาน 4 สัปดาห์ ซึ่งหนูจะถูกเหนี่ยวนำให้เกิดการอักเสบด้วยการออกกำลังกายในการทดสอบ consecutive forced swimming test (CST) และ physical fitness measurement tests (PT) พบว่า การแสดงออกของ IL-6 และ TNF-α mRNA ในกล้ามเนื้อน่อง (soleus muscle) ของหนูที่ได้รับสารสกัดน้ำ-แอลกอฮอล์ มีแนวโน้มลดลง การทดสอบเพิ่มเติมในหลอดทดลองของสารสกัดน้ำ-แอลกอฮอล์ และสารสำคัญที่แยกได้ด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟฟีจำนวน 8 ชนิด ได้แก่ 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone (0.66%), 5-hydroxy-7-methoxyflavone (0.52%), 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone (0.81%), 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone (0.30%), 3,5,7,3′,4′-pentamethoxyflavone (2.94%), 5,7,4′-trimethoxyflavone (3.14%), 3,5,7,4′-tetramethoxyflavone (1.75%), และ 5,7-dimethoxyflavone (2.5%) โดยเลี้ยงเซลล์กล้ามเนื้อตั้งต้น (myoblast) ชนิด C2C12 ร่วมกับสารสกัดน้ำ-แอลกอฮอล์ขนาด 10 มคก./มล. หรือเลี้ยงร่วมกับสารสำคัญทั้ง 8 ชนิดขนาด 10 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลานาน 1 สัปดาห์ จากนั้นนำเซลล์ไปเลี้ยงร่วมกับสารก่อการอักเสบLPS ความเข้มข้น 1 มคก./มล. นาน 1 ชม. พบว่า สารสกัดน้ำ-แอลกอฮอล์สามารถยับยั้งการแสดงออกของ IL-6 และ TNF-α mRNA ได้เล็กน้อย ในขณะที่สาร 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone,  สาร 5-hydroxy-7-methoxyflavone, และสาร 5,7-dimethoxyflavone สามารถยับยั้งการแสดงออกของ IL-6 mRNA ได้อย่างชัดเจน ในขณะที่สาร 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone,สาร 3,5,7,4′-tetramethoxyflavone, และสาร 5,7-dimethoxyflavoneสามารถยับยั้งการแสดงออกของ TNF-α mRNA ได้อย่างชัดเจนแสดงให้เห็นว่า สารสกัดน้ำ-แอลกอฮอล์ และสารสำคัญที่แยกได้จากกระชายดำ มีฤทธิ์ต้านการอักเสบ โดยมีกลไกในการยับยั้ง IL-6 และ TNF-α mRNA (15)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัด 95% เอทานอล และสาร 5,7-dimethoxyflavone ซึ่งแยกได้จากสารสกัดดังกล่าว โดยเหง้ากระชายดำมาจากแหล่งปลูกในจังหวัดกรุงเทพมหานคร และผลิตสารสกัดโดยบริษัท Biocm Co., Ltd. ประเทศเกาหลี ทำการสกัดโดยการแช่ผงกระชายดำแห้งใน 95% เอทานอลที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลานาน 24 ชม. จากนั้นนำมากรอง และทำให้เข้มข้นโดยการลดความดันในเครี่อง rotary evaporator วิเคราะห์สาร 5,7-dimethoxyflavone ด้วย UPLC-QTOF-MS ทำการทดสอบฤทธิ์ยับยั้ง NO, COX-2, TNF-α, และ NF-κB ในเซลล์ macrophage ชนิด RAW264.7 ที่ถูกเหนี่ยวนำให้เกิดการอักเสบด้วย LPS โดยใช้สารสกัดขนาด 5, 10, และ 20 มคก./มล. พบว่า สารสกัด 95% เอทานอลยับยั้งการแสดงออก iNOS, COX-2, และ TNF-α อย่างชัดเจน ส่งผลให้ระดับของNO, COX-2, และ TNF-α ลดลง เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้ นอกจากนี้ยังลดการเกิด phosphorylation ของ inhibitor kappa B-alpha (IκBα) และ NF-κB  รวมทั้งยับยั้งกระบวนการ nuclear translocation ของ NF-κB p65 ด้วย เช่นเดียวกับการทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบในเซลล์ผิวหนัง (keratinocytes) ชนิด HaCaT ที่ทำให้ติดเชื้อ P. acnesโดยใช้สาร 5,7-dimethoxyflavone ขนาด 3 และ 4 ไมโครโมลาร์ พบว่าสาร 5,7-dimethoxyflavone สามารถยับยั้งการแสดงออกของ iNOS และ NF-κB ได้ดีเช่นกัน (8)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดเมทานอลและสารสำคัญที่แยกได้ของเหง้ากระชายดำจากประเทศญี่ปุ่น (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งทำการสกัดโดยนำผงกระชายแห้งมาสกัดด้วยวิธีสกัดแบบไหลย้อนกลับด้วยเมทานอล เป็นเวลานาน 2 ชม. กรอง และทำให้เข้มข้นโดยการลดความดัน นำสารสกัดที่ได้มากระจาย (suspend) ในน้ำ และนำไปสกัดแยกชั้นด้วยเอทิลอะซิเตทเอ็น-บิวทานอลและน้ำซึ่งจะได้ส่วนสกัดเอทิลอะซิเตทส่วนสกัดเอ็น-บิทานอล และส่วนสกัดน้ำ ตามลำดับ นำส่วนสกัดเอทิลอะซิเตทมาแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโคมาโตกราฟฟีและพิสูจน์โครงสร้างด้วย two-dimensional NMR spectra (COSY, HSQC, HMBC และ NOESY) จากนั้นนำมาทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้าง NO ในเซลล์ macrophage ชนิด RAW264.7 ซึ่งถูกเหนี่ยวนำให้เกิดการอักเสบด้วย interferon (IFN)-γและ LPS ขนาด 0.3 และ 100 นาโนกรัม/มล. ตามลำดับ จากผลการทดลอง พบว่ามีสารที่ออกฤทธิ์ได้ดี โดยมีค่า IC50น้อยกว่า 20 ไมโครโมลาร์ ดังนี้ สารกลุ่ม chalcones ได้แก่ flavokavin B และ flavokavin A มีค่า IC50เท่ากับ 2.51 และ 7.82 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับสารกลุ่ม flavones ได้แก่ 5,7-dimethylluteolin,  5,7,4′-trimethoxyflavone, และ 5,7,3′,4′-tetramethylluteolin มีค่า IC50เท่ากับ 9.03, 14.2, และ 16.6 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับสารกลุ่ม flavanones ได้แก่5,7-dimethoxyflavanone และ 5,7,3′-trimethoxy-4′-hydroxyflavanone มีค่า IC50เท่ากับ 14.3 และ 16.1 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับและ สารกลุ่ม diarylheptanoids ซึ่งเป็น curcumin derivatives 2 ชนิด ได้แก่ 1,7-diphenyl-1,6-heptadiene-3,5-dione และ 1-(4-hydroxyphenyl)-7-phenyl-1,6-heptadiene-3,5-dione มีค่า IC50 7.53 และ 6.61 ไมโครโมลาร์ตามลำดับ แสดงให้เห็นว่า สารสำคัญที่แยกได้จากส่วนสกัดเอทิลอะซิเตทของกระชายดำมีฤทธิ์ต้านการอักเสบ โดยออกฤทธิ์ยับยั้งการสร้าง NO (3)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัด 80% เอทานอลของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดสมุทรปราการ (ไม่ระบุ voucherspecimen) ซึ่งทำสกัดด้วยการนำผงกระชายดำ 1 ก. มาผสมกับ 80% เอทานอล 25 มล. นำส่วนที่ละลาย มาสกัดต่อกับน้ำร้อนอุณหภูมิ 80 OC โดยใช้ reflux condenser (ไม่ระบุระยะเวลา) นำสารสกัดที่ได้มากรอง และทำให้เข้มข้นด้วยระบบสุญญากาศ จากนั้นนำมาละลายในน้ำกลั่น 5 มล. และนำไปทำให้แห้งด้วยการแช่เยือกแข็ง (freeze dry) นำไปทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบด้วยวิธี UV-induced inflammatory activity, PGE2 assay, และ luciferase assay จากการทดลองฤทธิ์ต้านการอักเสบจากรังสีUV ในผิวหนังของหนูเม้าส์ไร้ขน (hairless) ที่ถูกเหนี่ยวนำให้การแสดงออกของ COX-2 เพิ่มขึ้นจากการได้รับแสง UV ที่มีความยาวคลื่นเท่ากับแสงจากดวงอาทิตย์ (solar wavelengths; sUV) พบว่าการทาสารสกัด 80% เอทานอลของกระชายดำขนาด 50 และ 100 มก./กก. บริเวณหลังหนู 1 ชม. ก่อนนำไปฉายรังสี sUV ขนาด46 กิโลจูล/ตร.ซม.สามารถยับยั้งการแสดงออกของ COX-2 ได้ ซึ่งสามารถยืนยันผลได้จากการทดสอบ immunohistological staining การทดลองฤทธิ์ต้านการอักเสบจากรังสี UV ในเซลล์ผิวของหนูเม้าส์ (mouse epidermal cell) ชนิด JB6 P+และเซลล์ผิวหนังของมนุษย์ (human keratinocyte) ชนิด HaCaT ที่ถูกเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้าง COX-2 และ PGE2 เพิ่มขึ้นจากการได้รับ sUV พบว่าสารสกัด 80% เอทานอลของเหง้ากระชายดำขนาด 100, 200 และ 400 มคก./มล. สามารถยับยั้งการสร้าง COX-2 และ PGE2 ได้ โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้ การศึกษาในเซลล์ JB6 P+ด้วย luciferase assay พบว่าการให้สารสกัด 80% เอทานอลของกระชายดำขนาด 100และ 200 มคก./มล. หลังจากเซลล์ได้รับ sUV สามารถยับยั้งการทำงานของ COX-2, ยับยั้งการเกิด NF-κB transcription และยับยั้งการเกิด phosphorylation ของ c-Junได้ และการให้สารสกัด 80% เอทานอลของกระชายดำขนาด 200 และ 400 มคก./มล. ยังสามารถยับยั้งการเกิด phosphorylation ของ MKK4-JNK, MKK3/6-p38, และ MEK/ERK ใน MAPK signaling pathway ด้วย การศึกษาเพื่อยืนยันผลโดยการทาสารสกัด 80% เอทานอลของกระชายดำขนาด 50 และ 100 มก./กก. บริเวณหลังของหนูเม้าส์ก่อนการได้รับ sUV ก็พบว่าหนูที่ได้รับสารสกัดมีการเกิด phosphorylation ของ MAPK ทุกชนิดลดลง การทดสอบเปรียบเทียบการออกฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัด 80% เอทานอลของกระชายดำพบว่ามีความใกล้เคียงกับการออกฤทธิ์ของสาร N-acetyl-L-cysteine (NAC) ซึ่งเป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่สามารถยับยั้งการแสดงออกของ COX-2 และยับยั้งการกระตุ้น MAPK signaling pathway ที่เกิดจากการได้รับ sUV ได้ จึงคาดว่าการได้รับ sUV ทำให้เกิดการอักเสบจากการกระตุ้นภาวะเครียดออกซิเดชัน (oxidative stress) ซึ่งอาจสรุปได้ว่า สารสกัด 80% เอทานอลของกระชายดำออกฤทธิ์ต้านการอักเสบด้วยกลไกในการต้านอนุมูลอิสระ การวิเคราะห์ทางเคมีพบว่าสารสกัด 80% เอทานอลของเหง้ากระชายดำมีสารในกลุ่ม polyphenols ได้แก่ ferulic acid, isorhamnetin, naringenin, luteolin, protocatechuic acid, caffeic acid, gentisic acid, hydroxybenzoic acid, gallic acid, apigenin, tectorigenin, malic acid และ tangeretin โดยมี gallic acid, apigenin, และ tangeretin เป็นส่วนประกอบหลัก ซึ่งสารดังกล่าวมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ดี จึงคาดว่าสารในกลุ่ม polyphenols มีส่วนในการออกฤทธิ์ต้านการอักเสบ (4)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัด 95% เอทานอลของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดเชียงใหม่ (voucher specimen: R-CMUKP002) ซึ่งสกัดโดยการนำเหง้ากระชายดำมาสับและสกัดด้วย 95% เอทานอล (ไม่ระบุวิธีสกัด) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลานาน 3 วัน นำมากรอง และทำให้เข้มข้นด้วยเครื่อง rotary evaporator ทำให้แห้งด้วยการแช่เยือกแข็ง โดยนำมาทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการหลั่ง IL-6 ของเซลล์มะเร็งปากมดลูกชนิด HeLa ซึ่งถูกเหนี่ยวนำด้วย epidermal growth factor (EGF) โดยใช้สารสกัดขนาด 3.75, 7.5, และ 15 มคก./มล. พบว่า สารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำสามารถทำให้การหลั่ง IL-6 ของเซลล์ HeLa ลดลง โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้ (31)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำจากจังหวัดเชียงใหม่  (voucher specimen: 023202) ซึ่งสกัดโดยการนำเหง้ากระชายดำแห้งมาบดหยาบๆ แช่สกัดด้วย 95% เอทานอล นาน 3 วัน นำมากรองและนำกากที่เหลือไปสกัดซ้ำอีก 2 ครั้ง รวมสารสกัดทั้งหมดแล้วทำให้เข้มข้นด้วยเครื่อง rotary evaporator นำสารสกัดที่ได้มาแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟฟี ซึ่งพบว่ามีสารสำคัญในกลุ่ม methoxyflavones จำนวน 4 ชนิดคือ 5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone (2.36%), 3,5,7,3′,4′-pentamethoxyflavone (PMF; 22.01%), 5,7-dimethoxyflavone (DMF; 32.88%), และ 5,7,4′-trimethoxyflavone (TMF; 26.00%) นำสารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำไปทดสอบฤทธิ์ยับยั้ง IL-6, TNF-α, PGE2, และ matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) ด้วยวิธี ELISA และทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้างNO ด้วย NO assay ในเซลล์มะเร็งไขข้อของมนุษย์ (human synovial sarcoma cell line)ชนิด SW982โดยใช้สารสกัดขนาด 3, 10, และ 30 มคก./มล. พบว่า สารสกัดขนาด 3-30 มคก./มล. สามารถยับยั้ง mRNA expression และ protein level ของ TNF-α ได้อย่างชัดเจน ทำให้ระดับของ IL-6 ลดลงค่อนข้างมาก สารสกัดที่ขนาด 30 มคก./มล. ลดการแสดงออกของยีน IL-1βสารสกัดขนาด 3-30 มคก./มล. ทำให้การแสดงออกของ COX-2, การแสดงออกของยีนของprostaglandin E synthase (PTGES) และระดับของ PGE2 ลดลงอย่างชัดเจน ทำให้การแสดงออกของยีนของ iNOS ลดลง ส่งผลให้ระดับ NO ลดลง ทำให้การแสดงออกของ MMP13 และยีนของ zinc transporter 8 (ZIP8) มีแนวโน้มลดลง โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้  และทำให้การหลั่งMMP13 จากเซลล์ลดลง การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสำคัญ 3 ชนิด (นำมาทดสอบเฉพาะสารประกอบที่มีอยู่ในปริมาณสูง) คือ DMF, TMF, และ PMF ที่ขนาด 10, 8, และ7 มคก./มล. ตามลำดับ พบว่าสามารถลดการแสดงออกของยีนของ TNF-α, IL-6, MMP13, และ ZIP8 ได้อย่างชัดเจน และ DMF และ TMF สามารถลดการแสดงออกของยีนของ IL-1βและ COX2 ได้ดี ในขณะที่ PMF ไม่สามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนของ IL-1β และกลับเพิ่มแสดงออกของยีนของ COX-2 ด้วย นอกจากนี้ยังพบว่า สารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำสามารถยับยั้งการเคลื่อนตัวของเซลล์ (cell migration), ลดการแสดงออกของ cadherin-11mRNA, และยับยั้งการเกิด phosphorylation ของ p38 MAPK, STAT1, และ STAT3 signaling molecules แต่ไม่มีผลต่อ NF-κB pathway จากผลการทดลองทั้งหมดแสดงให้เห็นว่า สารสกัด 95% เอทานอลของกระชายดำและสารสำคัญที่แยกได้โดยเฉพาะ DMF, TMF, และ PMF มีฤทธิ์ต้านการอักเสบ โดยมีกลไกการออกฤทธิ์เกี่ยวข้องกับการยับยั้ง IL-6, IL-1β, TNF-α, PGE2, MMP-13, NO,ZIP8, COX2, p38/STAT1 และ STAT3 pathway (16)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสกัดเอทิลอะซิเตทของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดกรุงเทพมหานคร (voucher specimen: ES280306) ซึ่งสกัดด้วยวิธีแช่สกัด โดยนำผงหยาบของเหง้ากระชายดำแห้งมาแช่ในเอทิลอะซิเตทที่อุณหภูมิห้อง นาน 48 ชม. จากนั้นระเหยตัวทำละลายออกด้วยอุณหภูมิ 40 OC จนสารสกัดแห้ง นำมาทำการทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้างและการแสดงออกของ IL-8 mRNA ในเซลล์มะเร็งกระเพาะอาหาร (gastric adenocarcinoma) ชนิด AGS ซึ่งถูกเหนี่ยวนำด้วยเชื้อ Helicobacter pyloriวิเคราะห์ผลการทดลองด้วย ELISA และ RT-PCR โดยใช้สารสกัดขนาด 16 มคก./มล. พบว่าสามารถยับยั้งการหลั่ง IL-8 ได้ประมาณ 60% ในเวลา 12 ชม. และทำให้การแสดงออกของ IL-8 mRNA ลดลง รวมทั้งทำให้ monocyte และ neutrophil chemotaxis ลดลงด้วย แสดงให้เห็นว่าสารสกัดเอทิลอะซิเตทของเหง้ากระชายดำมีฤทธิ์ต้านการอักเสบ โดยออกฤทธิ์ยับยั้ง IL-8 (32)

3.6 ต้านการแพ้ของผิวกาย (S016)

การศึกษาฤทธิ์ต้านการแพ้ของสารสกัดเอทานอลจากเหง้ากระชายดำจากจังหวัดเลย (voucher specimen: SKP 2061116) โดยการนำเหง้ากระชายดำแห้งมาบดแล้วสกัดด้วยวิธีสกัดแบบไหลย้อนกลับกับเอทานอล นาน 3 ชม. เมื่อนำมาทดสอบด้วยวิธี anti-allergic activity assay โดยศึกษาฤทธิ์ยับยั้งการหลั่ง β-hexosaminidase จากเซลล์ RBL-2HE3 พบว่ามีค่า IC50เท่ากับ10.9 มคก./มล. (33)

การศึกษาฤทธิ์ต้านการแพ้ของสารสกัดต่าง ๆ และสารสำคัญที่แยกได้จากเหง้ากระชายดำจากจังหวัดเลย (voucher specimen: SKP 2061116) โดยการนำเหง้ากระชายดำแห้งมาบด แล้วแช่สกัดด้วยเอทานอลที่อุฌหภูมิห้อง จากนั้นนำสารสกัดหยาบที่ได้มาทำให้เข้มข้นและสกัดแยกชั้นด้วยตัวทำละลายต่างๆ ได้แก่ เฮกเซน คลอโรฟอร์ม เอทิลอะซิเตท และน้ำ ซึ่งจะได้ส่วนสกัดเฮกเซน ส่วนสกัดคลอโรฟอร์ม ส่วนสกัดเอทิลอะซิเตท และส่วนสกัดน้ำ เมื่อนำมาทดสอบด้วยวิธี anti-allergic activity assay โดยศึกษาฤทธิ์ยับยั้งการหลั่ง β-hexosaminidase จากเซลล์ RBL-2HE3 พบว่าส่วนสกัดเฮกเซน ส่วนสกัดคลอโรฟอร์ม ส่วนสกัดเอทิลอะซิเตท และส่วนสกัดน้ำ มีค่า IC50เท่ากับ7.6, 8.3, >100, และ 65.8 มคก./มล. ตามลำดับ จากนั้นจึงนำส่วนสกัดเฮกเซนซึ่งมีฤทธิ์ดีที่สุดมาแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟฟี และเปรียบเทียบโครงสร้างสารด้วย 1H และ13CNMR spectral ซึ่งพบว่าสาร 5-hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone ออกฤทธิ์ดีที่สุด โดยมีค่า IC50 เท่ากับ 8.0 ไมโครโมลาร์ รองลงมาคือ สาร 5-hydroxy-7-methoxyflavone และสาร 5-hydroxy-7,4′-dimethoxyflavone โดยมีค่า IC50เท่ากับ 20.6 และ 26.0 ไมโครโมลาร์ตามลำดับ ส่วนสารสำคัญอื่น ๆ ที่แยกได้มีฤทธิ์ปานกลาง(มีค่า IC50ระหว่าง 37.5–66.5 ไมโครโมลาร์) โดยคาดว่ากลไกการออกฤทธิ์อาจเกี่ยวข้องกับการยับยั้งแคลเซียมเข้าสู่เซลล์ (inhibition of Ca2+influx to the cells) (17)

การศึกษาฤทธิ์ต้านการแพ้ของสาร polymethoxyflavones (PMFs) จำนวน 13 ชนิด ที่แยกได้จากเหง้ากระชายดำ (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) ด้วยวิธี antigen-induced β-hexosaminidase inhibitory assayโดยศึกษาฤทธิ์ยับยั้งการหลั่ง β-hexosaminidase จากเซลล์ RBL-2HE3 พบว่าสาร 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone และสาร 5,3′-dihydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone เป็นสารที่ออกฤทธิ์ได้ดี โดยคาดว่ากลไกการออกฤทธิ์เกี่ยวข้องกับการยับยั้ง calcium ionophores ได้แก่ A23187 และ 2,5-ditert-butylhydroquinone ซึ่ง calcium ionophores ดังกล่าวกระตุ้นให้เกิดการนำแคลเซียมเข้าสู่เซลล์ (calcium influx) การวิเคราะห์โปรตีน (Immunoblot analysis) พบว่าสารทั้งสองชนิดสามารถยับยั้งการเกิด phospholipase C (PLC) γ1 kinase phosphorylation ใน signaling pathway ที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการ degranulation ของเซลล์ และสาร 5,3′-dihydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone ยังยับยั้งการเกิด phosphorylation ของ spleen tyrosine kinase (Syk) ด้วย นอกจากนี้พบว่าสารทั้งสองชนิดไม่มีผลต่อระดับของ high affinity IgE receptor (FcεRI) ที่อยู่ภายในเซลล์ RBL-2H3 แต่ทำให้ระดับของ FcεRI ใน plasma membrane ลดลงจะเห็นได้ว่า สารสำคัญในกระชายดำออกฤทธิ์ต้านการแพ้ด้วยกลไกหลายอย่าง ซึ่งน่าจะเป็นประโยชน์ในการนำมาใช้เพื่อบรรเทาอาการแพ้ใน type I allergy ได้ (การแพ้แบบ Type I หรือ immediate hypersensitivity คือการแพ้ที่เกี่ยวข้องกับการกระตุ้น IgE) (18)

การศึกษาความปลอดภัยทางคลินิก

การศึกษาทางคลินิกแบบมีการสุ่ม ปกปิดสองทาง มียาหลอกเป็นกลุ่มควบคุม (randomized double-blind placebo-controlled study) ในอาสาสมัครสุขภาพดีชาวญี่ปุ่นจำนวน 52 คน เป็นเพศชาย 17 คน และเป็นเพศหญิง 35 คน เพื่อศึกษาความปลอดภัยของสารสกัดมาตรฐานน้ำ-เอทานอลของกระชายดำ (KPFORCE™, lot no. 81025100 บริษัทMaruzen Pharmaceuticals Co., Ltd. ประเทศญี่ปุ่น) ซึ่งประกอบด้วยstandardized polymethoxyflavone 8.0–12.0% และการวิเคราะห์ทางเคมีด้วยhigh-performance liquid chromatography พบสารสำคัญ 6 ชนิดได้แก่สาร 5,7-dimethoxyflavone, สาร3,5,7-trimethoxyflavone, สาร 5,7,4′-trimethoxyflavone, สาร 3,5,7,4′-tetramethoxyflavone, สาร5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone, และสาร 3,5,7,3′,4′-pentamethoxyflavone ทำการทดสอบโดยสุ่มแยกอาสาสมัครเป็น 2 กลุ่ม กลุ่มละ 26 คน กลุ่มที่ 1 ได้รับสารสกัดในรูปแบบยาเม็ดซึ่งประกอบด้วย KPFORCE® 150 มก./เม็ด จำนวน 5 เม็ด/วัน และกลุ่มที่ 2ได้รับยาที่ไม่มีสารสกัด (ยาหลอก) ทำการศึกษาเป็นเวลานาน 4 สัปดาห์ หลังสิ้นสุดการทดลอง ในกลุ่มที่ได้รับยาที่มีสารสกัด มีการรายงานว่าพบอาการไข้ 2 คน มีอาการไอ 2 คน และมีอาการเกร็งของกล้ามเนื้อหลังเฉียบพลันหรือหลังยอก (strained back) 1 คน แต่ไม่พบอาการแพ้ รวมทั้งไม่พบความผิดปกติของร่างกาย หลอดเลือดและหัวใจ ค่าเลือด หรือค่าปัสสาวะ แสดงให้เห็นว่า การรับประทานสารสกัดของกระชายดำในขนาดและระยะเวลาดังกล่าวของอาสาสมัครสุขภาพดีมีความปลอดภัย (34)

การทดสอบความเป็นพิษ

การทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลัน

การศึกษาความเป็นพิษของสาร 5,7-dimethoxyflavone ที่แยกได้จากเหง้ากระชายดำ (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) ในหนูแรท ด้วยวิธี hippocratic screening พบว่าสาร 5,7-dimethoxyflavone มีความเป็นพิษค่อนข้างต่ำ การให้ในขนาด 3 ก./กก. (10 เท่าของขนาดที่มีฤทธิ์ต้านการอักเสบ) และเฝ้าสังเกตอาการนาน 7 วันไม่พบการตายของสัตว์ทดลอง แต่การให้ในขนาดสูงกว่า 1.26 ก./กก. สามารถกดการหายใจ และลดอุณหภูมิร่างกายของสัตว์ทดลองอย่างชัดเจน (9)

การทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลันในหนูเม้าส์ ของสารสกัดเฮกเซนของเหง้ากระชายดำสายพันธุ์ภูเรือ-10 (ร่มเกล้า) จากจังหวัดเลย (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งได้จากการนำเหง้ากระชายดำแห้งมาบดแล้วหมักด้วยเฮกเซนนาน 3 วัน กรองแล้วนำกากมาหมักกับเฮกเซนอีก 2 ครั้ง ครั้งละ 3 วัน กรองครั้งสุดท้ายอีกครั้งแล้วทิ้งกาก ระเหยเฮกเซนที่อุณหภูมิไม่เกิน 50 OC ภายใต้ความดันต่ำ แล้วทำให้แห้งสนิทด้วยเครื่อง lyophilyzerจากนั้นป้อนสารสกัดเฮกเซนให้หนูเม้าส์กินในขนาด 2 ก./กก. เพียงครั้งเดียว แล้วเฝ้าสังเกตอาการของหนูนาน 14 วัน พบว่าหนูมีการเคลื่อนไหวน้อยลงเมื่อเทียบกับหนูกลุ่มที่ไม่ได้รับสารทดสอบ แต่ไม่พบความผิดปกติอื่น ๆ และไม่มีหนูตาย จึงสรุปว่าสารสกัดเฮกเซนมีค่า LD50มากกว่า 2 ก./กก. (35)

การทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลันในหนูเม้าส์ทั้ง 2 เพศ ของสารสกัดเอทานอลของเหง้ากระชายดำที่ได้จากร้านขายยาแผนไทยในจังหวัดสงขลา (voucher specimen: SKP2061116) ซึ่งสกัดโดยการนำเหง้ากระชายดำแห้งมาบดแล้วแช่สกัดด้วยเอทานอลที่อุฌหภูมิห้อง และนำมาทำให้เข้มข้นจากนั้นป้อนให้หนูกินในขนาด 300-2,000 มก./กก. เพียงครั้งเดียว เฝ้าสังเกตอาการอย่างใกล้ชิดที่เวลา 8 ชม. และ 7 วัน พบว่า การให้สารสกัดเอทานอลของเหง้ากระชายดำจนถึงขนาด 2 ก./กก. ไม่ทำให้สัตว์ทดลองเกิดความผิดปกติใด ๆ (11)

การศึกษาความเป็นพิษเฉียบพลันของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดเลย (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยการกรอกผงเหง้ากระชายดำทางปากแก่หนูถีบจักร พบว่าขนาดผงกระชายดำที่ทำให้สัตว์ทดลองตายครึ่งหนึ่ง (LD50) มีค่ามากกว่า 13.33 ก./กก. และไม่พบการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาที่ผิดปกติใดๆ ของอวัยวะภายใน (36)

การทดสอบในหนูแรทพบว่าการป้อนสารสกัดแอลกอฮอล์ (ไม่ระบุชนิดของแอลกอฮอล์และวิธีสกัด) ของเหง้ากระชายดำ (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) ขนาด 1 ก./นน.ตัว 1 กก./วัน นาน 5 สัปดาห์ ทำให้ตับของหนูโตขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (37)

การทดสอบความเป็นกึ่งเฉียบพลัน

การทดสอบความเป็นพิษกึ่งเฉียบพลันในหนูแรท ของสารสกัด 50% เอทานอลของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดเลย (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งได้จากการนำเหง้ากระชายดำแห้งมาบดแล้วสกัดด้วยอุปกรณ์ Soxhlet โดยใช้ 50% เอทานอลเป็นตัวทำละลาย นำมาระเหยแห้งด้วย rotary evaporator จากนั้นจึงป้อนสารสกัดให้หนูในขนาด 60, 120, และ 240 มก./นน.ตัว 1 กก. เป็นเวลานาน 60 วัน พบว่าที่ขนาดดังกล่าวไม่ทำให้เกิดความผิดปกติกับระบบเลือด การทำงานของตับและไตของสัตว์ทดลอง โดยค่า blood urea nitrogen (BUN), creatinine (Crea), aspartate aminotransferase (AST) และ alanine aminotransferase (ALT) อยู่ในเกณฑ์ปกติ แต่การตรวจสอบในระดับเนื้อเยื่อพบว่ารูปร่างของตับมีการเปลี่ยนแปลงไป ดังนั้นจึงไม่แนะนำให้ใช้เหง้ากระชายดำเป็นระยะเวลานาน หรือใช้ในขนาดสูง เนื่องจากอาจทำให้ตับเกิดความผิดปกติได้ (38)

การศึกษาความปลอดภัยของสารสกัดมาตรฐานน้ำ-เอทานอลของเหง้ากระชายดำ(KPFORCE™, lot no. 61121028 บริษัท Maruzen Pharmaceuticals Co., Ltd. ประเทศญี่ปุ่น) ซึ่งประกอบด้วย standardized polymethoxyflavone 8.0–12.0% และการวิเคราะห์ทางเคมีด้วย high-performance liquid chromatography(HPLC) พบสารสำคัญ 6 ชนิดได้แก่สาร 5,7-dimethoxyflavone, สาร 3,5,7-trimethoxyflavone, สาร 5,7,4′-trimethoxyflavone, สาร 3,5,7,4′-tetramethoxyflavone, สาร 5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone, และสาร 3,5,7,3′,4′-pentamethoxyflavone โดยทดสอบความเป็นพิษกึ่งเรื้อรังในหนูแรทสายพันธุ์ Sprague-Dawley โดยป้อนหนูด้วย KPFORCE™ ขนาด  75, 375, และ 747 มก./นน.ตัว 1 กก./วัน (เทียบเท่ากับได้รับสารสกัดกระชายดำ 25, 125, และ 249 มก./นน.ตัว 1 กก./วัน ตามลำดับ) เป็นเวลานาน 90 วัน แล้วประเมินผลสัปดาห์ละ 1 ครั้ง ทำการวิเคราะห์ผลเลือด ค่าทางชีวเคมี อวัยวะภายใน และเนื้อเยื่อต่าง ๆ เมื่อสิ้นสุดการทดลอง พบว่าสัตว์ทดลองมีการเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อย เช่น ในหนูกลุ่มที่ได้รับสารสกัดขนาดสูงสุด (249 มก./นน.ตัว 1 กก./วัน) มีปริมาณของน้ำลายเพิ่มขึ้น ไม่พบความผิดปกติของค่าทางชีวเคมีที่บ่งชี้ถึงการเกิดพิษ และหนูกลุ่มที่ได้รับสารสกัดขนาดต่ำสุด (25 มก./นน.ตัว 1 กก./วัน)มีระดับเกล็ดเลือดเพิ่มขึ้น อย่างไรก็ตาม ค่าความเปลี่ยนแปลงต่าง ๆ ที่เกิดขึ้น ยังอยู่ในช่วงของค่าปกติ และไม่พบความผิดปกติใด ๆ ของเนื้อเยื่อ (39)

การทดสอบความเป็นพิษเรื้อรัง

การศึกษาความเป็นพิษเรื้อรังระยะเวลา 6 เดือน  ในหนูแรททั้ง 2 เพศ พบว่าหนูที่ได้รับผงกระชายดำจากจังหวัดเลย (ไม่ระบุ voucher specimen) ทางปากในขนาด 2ก./กก./วัน มีน้ำหนักตัวเพิ่มขึ้น อาการและสุขภาพไม่แตกต่างจากกลุ่มควบคุม น้ำหนักสัมพัทธ์ของตับสูงกว่ากลุ่มควบคุม แต่อาจเนื่องมาจากมีน้ำหนักตัวต่ำกว่ากลุ่มควบคุม มีเม็ดเลือดขาวชนิด eosinophil ต่ำกว่ากลุ่มควบคุม แต่ยังอยู่ในช่วงของค่าปกติ มีระดับโซเดียมในเลือดสูงกว่ากลุ่มควบคุม แต่ยังคงอยู่ในช่วงค่าปกติ ในหนูเพศเมียมีระดับคอเลสเตอรอลสูงกว่ากลุ่มควบคุม ผลการตรวจอวัยวะภายในทางจุลพยาธิวิทยาไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่บ่งชี้ว่าเกิดจากความเป็นพิษของกระชายดำ (36)

การทดสอบความเป็นพิษเรื้อรังของสารสกัด 95% เอทานอล (ไม่ระบุวิธีสกัด) ของเหง้ากระชายดำจากจังหวัดพิษณุโลก (voucher specimen: KP-CRD10D) ในหนูแรทจำนวน 120 ตัว โดยแบ่งออกเป็น 5 กลุ่ม กลุ่มละ 24 ตัว (เพศละ 12 ตัว) โดยเป็นกลุ่มทดลองจำนวน3 กลุ่ม ซึ่งจะได้รับสารสกัดกระชายดําโดยการป้อนทางปากในขนาด 5, 50 หรือ500 มก./กก./วัน เป็นเวลา 6 เดือน หรือเทียบเท่ากับ 1, 10 และ 100 เท่าของขนาดกระชายดำที่คนรับประทาน และเป็นกลุ่มควบคุมจำนวน2 กลุ่ม ซึ่งจะได้รับน้ำกลั่นหรือสารละลาย 1% ทรากาแคนท์ผลการทดลองพบว่า สารสกัดกระชายดําขนาด 500 มก./กก./วัน ทําให้หนูเพศผู้มีน้ำหนักตัวต่ำกว่ากลุ่มควบคุมที่ได้รับน้ำและทรากาแคนท์อย่างมีนัยสำคัญ (p< 0.05) การเปลี่ยนแปลงค่าทางโลหิตวิทยาในกลุ่มที่ได้รับสารสกัดขนาด 500 มก./กก./วัน ยังคงอยู่ในช่วงปกติ หนูเพศผู้ที่ได้รับสารสกัดกระชายดำขนาด 500 มก./กก./วัน มีค่าไตรกลีเซอไรด์ต่ำกว่ากลุ่มควบคุมทั้งสองกลุ่มอย่างมีนัยสำคัญ (p< 0.05) ในขณะที่หนูเพศเมียที่ได้รับสารสกัดขนาดเท่ากันมีค่ากลูโคสและคอเลสเตอรอลสูงกว่ากลุ่มควบคุมทั้งสองกลุ่มอย่างมีนัยสำคัญ (p< 0.05) อย่างไรก็ตาม ผลการตรวจจุลพยาธิวิทยาของอวัยวะต่างๆ ไม่พบความผิดปกติใดๆ ที่บ่งชี้ถึงความเป็นพิษเรื้อรังจากการได้รับสารสกัดกระชายดำ (40)

การทดสอบความเป็นพิษเรื้อรังของสารสกัดเอทานอลของเหง้ากระชายดำ (ไม่ระบุวิธีสกัด) จากจังหวัดเลย (ไม่ระบุ voucher specimen) ในหนูแรททั้ง 2 เพศ โดยป้อนหนูด้วยสารสกัดขนาด 5, 50, และ 500 มก./นน.ตัว 1 กก. นาน 6 เดือน พบว่าที่ขนาด 500 มก./นน.ตัว 1 กก. ทำให้น้ำหนักตัวของหนูเพศผู้ลดลง น้ำหนักของหัวใจ ปอด ตับ กระเพาะอาหาร ไต และกระเพาะปัสสาวะของหนูเพศผู้สูงกว่ากลุ่มควบคุม ส่วนในหนูเพศเมียมีน้ำหนักของหัวใจ ปอก ตับ กระเพาะอาหาร และไตข้างขวาเพิ่มขึ้น นอกจากนี้ที่ขนาด 500 มก./นน.ตัว 1 กก. ยังทำให้เม็ดเลือดขาวชนิด eosinophil ของหนูเพศผู้ลดลง ส่วนหนูเพศเมียมีจำนวนของเม็ดเลือดขาวชนิด neutrophil ลดลง และจำนวนเม็ดเลือดขาวชนิดlymphocyte เพิ่มขึ้น (41)

การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์

การทดสอบความเป็นพิษต่อเม็ดเลือดขาวชนิด lymphocyte ของสารสกัดเฮกเซน สารสกัดไดคลอโรมีเทน และสารสกัดเอทานอลของเหง้ากระชายดำสายพันธุ์ร่มเกล้าจากจังหวัดเลย (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งสกัดด้วยอุปกรณ์ Soxhlet แล้วนำมาทดสอบด้วยวิธี 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay โดยใช้สารสกัดที่ขนาด 1, 3, 5, 7, และ 10 มคก./มล. ที่เวลา 24, 48, และ 72 ชม. พบว่าสารสกัดทุกชนิดไม่มีความเป็นพิษต่อเม็ดเลือดขาว (22)

ฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์

การทดสอบฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์ของสารสกัดเฮกเซน สารสกัดเอทานอล และสารสกัดน้ำของเหง้ากระชายดำสายพันธุ์ร่มเกล้าจากจังหวัดเลย (ไม่ระบุ voucher specimen) ซึ่งได้จากการสกัดต่อเนื่องด้วยวิธี soxhletextraction โดยทำการทดสอบใน Salmonella typhimurium TA98, TA100 พบว่าสารสกัดทุกชนิดไม่มีฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์ (22)

การศึกษาความปลอดภัยของสารสกัดมาตรฐานน้ำ-เอทานอลของกระชายดำ (KPFORCE™, lot no. 61121028 บริษัท Maruzen Pharmaceuticals Co., Ltd. ประเทศญี่ปุ่น) ซึ่งประกอบด้วย standardized polymethoxyflavone 8.0–12.0 โดยทดสอบความเป็นพิษต่อยีนด้วยวิธี bacterial reverse mutation testต่อ Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537, และEscherichia coli WP2 uvrA โดยใช้สารสกัดความเข้มข้น 39.1, 78.1, 156, 313, 625, และ1250 มคก./plate ในการทดสอบกับS. typhimurium TA100, TA1535, TA1537 ใช้สารสกัดความเข้มข้น156, 313, 625,1250, 2500, 5000มคก./plate ในการทดสอบกับ S. typhimuriumTA98 และใช้สารสกัดความเข้มข้น313, 625, 1250, 2500, 5000มคก./plate ในการทดสอบกับE. coli WP2 uvrA พบว่าสารสกัดดังกล่าวทุกขนาดความเข้มข้น ไม่ก่อให้เกิดความเป็นพิษต่อยีน (39)

ยังไม่มีรายงานข้อห้ามใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง

ยังไม่มีรายงานข้อควรระวังการใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง

ยังไม่มีรายงานอาการไม่พึงประสงค์จากการใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง

ไม่มีข้อมูล เนื่องจากยังไม่มีรายงานการศึกษาในคน มีแต่การศึกษาในหลอดทดลองหรือสัตว์ทดลอง

DIP (THAILAND-TH)

DIP (THAILAND-EN)

USPTO (USA)