การตรวจสอบสารพฤกษเคมีเบื้องต้นของดอกอัญชัน (22)

การตรวจสอบสารกลุ่ม carbohydrates (Molisch’s test)

นำสารสกัดเมทานอลของดอกอัญชัน 1 มล. มาเติมกรดซัลฟูริกเข้มข้น 2 มล. ผสมให้เข้ากัน ทิ้งไว้ 2-3 นาที ให้ผลเป็นบวกเมื่อเกิดสารละลายสีแดงหรือสีม่วงไวโอเลตบริเวณรอยต่อของชั้นสาร

การตรวจสอบสารกลุ่ม glycosides (Keller Kelliani’s test)

นำสารสกัดเมทานอลของดอกอัญชัน 1 มล. มาเติม glacial acetic acid  0.5 มล. เติมสารละลายเฟอร์ริกคลอไรด์ 1 หยดจากนั้นค่อย ๆ เติมกรดซัลฟูริกเข้มข้น 1 มล. ลงไป ให้ผลเป็นบวกเมื่อเกิดวงแหวนสีน้ำตาลบริเวณรอยต่อของชั้นสาร

การตรวจสอบสารกลุ่ม flavonoids (Alkaline reagent test) 

นำสารสกัดเมทานอลของดอกอัญชัน 2 มล. มาเติมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ความเข้มข้น 20% 2-3 หยด ให้ผลเป็นบวกเมื่อเกิดสารสีเหลือง และกลายเป็นสารไม่มีสีเมื่อเติมกรดไฮโดรคลอริกเจือจาง

การตรวจสอบสารกลุ่ม phenols (Ferric chloride test)

นำสารสกัดเมทานอลของดอกอัญชัน 1 มล. มาเติมสารละลายเฟอร์ริกคลอไรด์ความเข้มข้น 5% ในน้ำให้ผลเป็นบวกเมื่อเกิดสารสีน้ำเงินเข้มหรือสีดำ

การตรวจสอบสารกลุ่ม tannins (Precipitate test) 

นำสารสกัดเมทานอลของดอกอัญชัน 2 มล. มาต้มกับกรดไฮโดรคลอริกความเข้มข้น 1% ในน้ำ 1 มล. ให้ผลเป็นบวกเมื่อเกิดตะกอนสีแดง

การตรวจสอบสารกลุ่มเทอร์ปีนอยด์ (Salkowki’s test)

นำสารสกัดเมทานอลของดอกอัญชัน 1 มล. มาเติมคลอโรฟอร์ม 1 มล. หยดกรดซัลฟูริกเข้มข้น 2-3 หยด ให้ผลเป็นบวกเมื่อเกิดตะกอนสีน้ำตาลแดงทันที 

การสกัดสารกลุ่ม flavonoids (กลุ่ม anthocyanins)

ตัวอย่างที่ 1 การสกัดสาร anthocyanins สามารถทำได้โดยนำดอกอัญชันมาสกัดด้วยกรดไฮโดรคลอริก 1%v/v ในเมทานอล (0.1% HCl (v/v)in methanol) (ไม่ระบุวิธีการสกัด) นาน 2-3 ชม. ที่อุณหภูมิห้องและมืด กรอง และล้างกากด้วยกรดไฮโดรคลอริก 1%v/v ในเมทานอล จนสารละลายใส ระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary evaporator ที่อุณหภูมิ 30oC นำสารสกัดที่ได้มาละลายด้วยกรดไฮโดรคลอริก 0.01%v/v ในน้ำจากนั้นจึงนำไปทำให้บริสุทธิ์และวิเคราะห์ชนิดของสาร anthocyanins ต่อไป (23)

ตัวอย่างที่ 2 การศึกษาเพื่อหาวิธีสกัดสาร anthocyanins จากดอกอัญชันให้ได้ปริมาณมากที่สุด โดยนำดอกอัญชันแห้งที่บดละเอียดแล้ว มาทำการสกัดโดยเปรียบเทียบความเข้มข้นของตัวทำละลาย (เอทานอล 20-80%) ระยะเวลาในการสกัด (15-75 นาที) อุณหภูมิ (40-80 oC) และอัตราส่วนของตัวทำละลาย/สมุนไพร (10: 1 ถึง 30: 1) จากนั้นนำสารสกัดที่ได้ไปปั่นด้วยเครื่อง centrifuge ความเร็ว 4,000 รอบ/นาที นาน 15 นาที เก็บส่วนใส กรอง และนำไปวิเคราะห์ด้วยวิธี spectrophotometric pH differential method โดยใช้ช่วงความยาวคลื่น 400 - 700 นาโนเมตร ซึ่งจะแสดงปริมาณของ monomeric anthocyanin ในรูปของ cyanidin-3-glycoside พบว่าสภาวะที่เหมาะสมที่สุดในการสกัดสาร anthocyanins คือ ตัวทำละลาย 50% เอทานอล ระยะเวลา 30 นาที อุณหภูมิ 60 oC อัตราส่วนของตัวทำละลายต่อสมุนไพรเท่ากับ 25 : 1 มล./ก. ซึ่งจะทำให้ได้สาร anthocyanins 143.49 มก./ล. (24-25)

ตัวอย่างที่ 3 การศึกษาเพื่อหาวิธีสกัดสาร anthocyanins จากดอกอัญชันให้ได้ปริมาณมากที่สุด โดยใช้วิธี ultrasonic-assisted extraction (UAE) method ทำได้โดยนำดอกอัญชันสดมาสกัดด้วยน้ำโดยใช้อุปกรณ์ ultrasonic cleaning bath (KRISBOW model KW1801033, voltage 240 V/50 Hz, maximum power 100 W, maximum frequency 40 kHz, tank capacity 2.8 liter) อัตราส่วนของสมุนไพรต่อตัวทำละลาย (ratio of feed to solvent) 0.02-0.1 ก./มล. เวลาในการสกัด 30-150 นาทีอุณหภูมิ 30-60 oC ค่า pH 3-11 นำสารที่ได้มากรอง นำไปวัดค่าการดูดกลืนแสงด้วย UV-Vis spectrophotometer โดยใช้ช่วงความยาวคลื่น 500 - 700 นาโนเมตร จากผลการศึกษาพบว่าสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการสกัดสาร anthocyanins จากดอกอัญชันคือ อัตราส่วนของสมุนไพรต่อตัวทำละลายคือ 0.02 ก./มล. ระยะเวลา 90 นาที อุณหภูมิ 60 oC และค่า pH เท่ากับ 7 ซึ่งจะทำให้ได้สาร anthocyanins 1.425 ก./ล. (26)

การวิเคราะห์ปริมาณสารกลุ่ม flavonoids (กลุ่ม anthocyanins)

ตัวอย่างที่ 1 การวิเคราะห์ปริมาณ anthocyanins ด้วยวิธี pH differential method ทำได้โดย นำดอกอัญชันแช่แข็ง 1,000 มก. มาแบ่งเป็น 2 ส่วน ส่วนละ 500 มก. ส่วนที่ 1 นำมาเติมสารละลายบัฟเฟอร์ pH 1.0 ปริมาตร 10 มล. (ประกอบด้วยสารละลายโพแทสเซียมคลอไรด์ความเข้มข้น 0.2 โมลาร์ 125 มล. และสารละลายกรดไฮโดรคลอริกความเข้มข้น 0.2 โมลาร์ 375 มล.) ส่วนที่ 2 นำมาเติมสารละลายบัฟเฟอร์ pH 4.5ปริมาตร 10 มล. (ประกอบด้วยสารละลายโซเดียมอะซิเตทความเข้มข้น 1 โมลาร์ 400 มล.,สารละลายกรดไฮโดรคลอริกความเข้มข้น 1 โมลาร์ 240 มล. และน้ำกลั่น 360 มล.) นำไปปั่นให้ละเอียดและนำไปผ่านเครื่อง centrifuge 2 ครั้ง ที่อุณหภูมิ 4oC ความเร็ว 5,000 รอบ/นาที นาน 15 นาที นำส่วนใสที่ได้ไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 510 นาโนเมตร คำนวณปริมาณ anthocyanins ด้วยสมการ

เมื่อ A คือค่าการดูดกลืนแสง = (Aλvis-max)pH 1.0 − (Aλvis-max)pH 4.5

MW คือ น้ำหนักโมเลกุล (ก./โมล) = 449.2ก./โมล สำหรับ cyanidin-3-glucoside

DF คือ ค่า dilution factor (ค่า DF =10เมื่อตัวอย่าง 0.2มล. ถูกเจือจางให้เป็น 2มล.)

ε คือค่า extinction coefficient (L × cm−1 × mol−1) = 26,900สำหรับ cyanidin-3-glucoside 

l คือ path length ในหน่วยเซนติเมตรเท่ากับ1

ซึ่งจะแสดงปริมาณของ anthocyanins เป็นปริมาณเทียบเท่ากับ cyanidin-3-glucoside (cyanidin-3-glucoside equivalents) (23)

ตัวอย่างที่ 2 การวิเคราะห์ปริมาณสารanthocyanins ด้วยวิธี High-performance liquid chromatography (HPLC) (WatersTM2690 HPLC มี diode-array detector) มีสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (27)

Column: C18 (250x4.6 mm) (Luna® 5μm C18(2) 100 Å)

Solvent system: solvent A คืออะซิโตไนไตรล์ (MeCN) และ solvent B คือสารละลาย 10%กรดอะซิติก (AcOH) ในน้ำกลั่น; gradient system ที่เวลา 0นาที100% B; ที่เวลา 40นาที24% A และ76% B; ที่เวลา 41นาที 100% B; ที่เวลา 45นาที

Injection volume: 20มคล. 

Detector: diode-array detector ช่วงความยาวคลื่น 300 - 500นาโนเมตร

Flow speed: 1มล./นาที

Run time: 45 นาที

Reference standard: cyanidin-chloride 

การวิเคราะห์ปริมาณผลรวมสาร phenolic compound 

การวิเคราะห์ปริมาณผลรวมสารphenolic compound ของสารสกัดน้ำจากดอกอัญชันทำได้โดย นำสารสกัด 0.1 มล. มาเติมน้ำ 5.9 มล.,Folin-Ciocalteu reagent 0.5มล., และสารละลายโซเดียมคาร์บอเนต (Na2CO3) ความเข้มข้น 20% w/v 1.5 มล. ผสมให้เข้ากันด้วยเครื่อง vortex นำไปตั้งบน water bath อุณหภูมิ 70 oC นาน 10 นาทีนำไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 765 นาโนเมตร ด้วยเครื่อง SpectraMax i3 spectrophotometer คำนวณปริมาณผลรวมของสารฟีนอลิกโดยการใช้กราฟมาตรฐาน (standard curve) ของ gallic acid และแสดงผลในหน่วยกรัมของน้ำหนักสารสกัดแห้งเทียบเท่ามิลลิกรัมของ gallic acid(mg of gallic acid equivalent/g of DW) (28)

การวิเคราะห์ปริมาณผลรวมสารกลุ่ม flavonoids 

การวิเคราะห์ปริมาณผลรวมสารกลุ่มflavonoids ของสารสกัดน้ำจากดอกอัญชันทำได้โดย เติมน้ำกลั่น 100 มคล., สารละลายโซเดียมไนไตรท์ (NaNO2) ความเข้มข้น 50 ก./ล. 10 มคล., และสารสกัดหรือสารมาตรฐาน 25 มคล. ลงในไมโครเพลท (96 well plate) หลังจากผสมให้เข้ากัน ทิ้งไว้ 5 นาที เติมสารละลายอลูมิเนียมคลอไรด์ (AlCl3) ความเข้มข้น 100 ก./ล. 15 มคล. หลังจากนั้น 6 นาที เติมสารละลายโซเดียมไฮ-ดรอกไซด์ (NaOH) ความเข้มข้น 1 โมลาร์ 50 มคล. และน้ำกลั่น 50 มคล. นำไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 510 นาโนเมตร ด้วยเครื่อง SpectraMax i3 spectrophotometer คำนวณปริมาณผลรวมของflavonoids โดยการใช้กราฟมาตรฐาน (standard curve) ของ quercetin และแสดงผลในหน่วยกรัมของน้ำหนักสารสกัดแห้งเทียบเท่ามิลลิกรัมของ quercetin (mg of QE/g of DW) (28)

การวิเคราะห์ปริมาณสารกลุ่ม proanthocyanidins

การวิเคราะห์ปริมาณสารกลุ่ม proanthocyanidins ของสารสกัดน้ำจากดอกอัญชันทำได้โดยนำสารสกัดหรือสารมาตรฐาน 500 มคล. มาผสมกับสารละลาย vanillin (vanillin solution) ความเข้มข้น 4% w/v 3 มล. และกรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น (concentrated HCl) 1.5 มล. ทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง นาน 15 นาที นำไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 500 นาโนเมตรคำนวนปริมาณสารกลุ่มproanthocyanidins ด้วย regression equation ของ catechin และแสดงผลในหน่วยกรัมของน้ำหนักสารสกัดแห้งเทียบเท่ามิลลิกรัมของ catechin (mg CE/g DW)(28)

การวิเคราะห์ปริมาณผลรวมสารกลุ่มflavonols 

การวิเคราะห์ปริมาณผลรวมสารกลุ่มflavonols ของสารสกัดน้ำจากดอกอัญชันทำได้โดย นำสารสกัดหรือสารมาตรฐาน 2 มล. มาผสมกับสารละลายอลูมิเนียมคลอไรด์ (AlCl3) ความเข้มข้น 2% 2 มล. และสารละลายโซเดียมอะซิเตทความเข้มข้น 50 ก./ล. 3 มล. ผสมให้เข้ากันด้วยเครื่อง vortex เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 oC นาน 2 ชม. 30 นาที นำไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 440 นาโนเมตร คำนวณปริมาณผลรวมของสารกลุ่มflavonols ด้วย regression equation ของ quercetin และแสดงผลในหน่วยกรัมของน้ำหนักสารสกัดแห้งเทียบเท่ามิลลิกรัมของ quercetin (mg of QE/g of DW) (28)

การแยกและวิเคราะห์สารสำคัญจากดอกอัญชัน

ตัวอย่างที่ 1 การสกัดและแยกสารกลุ่ม anthocyanins จากดอกอัญชันได้แก่ ternatin A1, A2, A3, B1, B2, B3, B4, D1, และ D2 ทำได้โดยนำดอกอัญชันมาอบแห้งที่อุณหภูมิ 45 oC นาน 1 คืน นำดอกอัญชันแห้ง 200 ก. มาแช่สกัดด้วย 80% เมทานอล 300 มล. นาน 1 คืน กรอง ทำซ้ำ 4 ครั้ง รวมสารสกัดที่ได้ นำไปวิเคราะห์สารสำคัญด้วย HPLC (L-6200 intelligent pump system) ซึ่งมีสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (14)

Column: Inertsil ODS-2 (4.6 i.d. x 50 mm + 4.6 i.d. x 250 mm) อุณหภูมิ column 35 OC

Flow rate: 1 มล./นาที

Detector: UV–Vis detector ที่ความยาวคลื่น 312 นาโนเมตรสำหรับ UV-absorbing compounds และที่ความยาวคลื่น 530 นาโนเมตรสำหรับสาร anthocyanins

Solvent system: linear gradient elution นาน 45 นาทีจาก 25% ถึง 70% ของ solvent B (1.5% กรดฟอสฟอริก (H3PO4),20% AcOH, 25% MeCN ในน้ำ) ใน solvent A (1.5% H3PO4ในน้ำ)

สารสำคัญต่าง ๆ จะมี retention times (นาที) และ contents % ดังนี้ ternatin A3 (13.9 นาที, 3%), B4 (18.9 นาที, 4%), A2 (23.3นาที, 7%), B3 (25.9 นาที, 4%), A1 (26.3 นาที, 2%), B2 (32.1 นาที,16%), B1 (33.4 นาที, 16%), D2 (35.1 นาที, 11%), และ D1 (40.0 นาที, 12%)จากนั้นนำสารสกัดที่ได้ไประเหยตัวทำละลายออกจนแห้ง และนำไปละลายอีกครั้งใน 50% เมทานอล นำมาสกัดเป็นลำดับด้วยคลอโรฟอร์ม เอ็น-บิวทานอล และน้ำ นำสารสกัดน้ำไประเหยตัวทำละลายออกจนแห้ง และนำไปละลายอีกครั้งใน 1% AcOH นำไปเคลือบบน HP-20 resin และแยกด้วย column ซึ่งบรรจุ HP-20 resin (60 i.d. x 450 mm) โดยล้างด้วย 1% AcOH และล้าง column (elute) ด้วย 1% AcOH ใน70% เอทานอล นำสารที่ได้ไประเหยตัวทำละลายออกจนแห้ง และนำไปละลายอีกครั้งในกรดไฮโดรคลอริก (0.1 N HCl) : เมทานอล (3:7) และแยกด้วย column ซึ่งบรรจุ polyvinylpyrrolidone (PVP) (45 i.d. x 100 mm) ล้าง column ด้วยตัวทำละลายชนิดเดียวกัน นำสารที่แยกได้มาใส่ใน column ที่บรรจุ HP-20 เพื่อกำจัดกรดไฮโดรคลอริก และล้างด้วย 1% AcOH จากนั้นจึงล้าง column ด้วย 1% AcOH ใน70% เอทานอล ซึ่งจะได้ส่วนสกัด 3 ส่วนโดยสาร ternatin A1, A2, และ A3จะอยู่ในส่วนสกัดที่ 1, สาร ternatins B4, B3, B2, และ B1 จะอยู่ในส่วนสกัดที่ 2,และสาร ternatins D2 และ D1จะอยู่ในส่วนสกัดที่ 3 สาร ternatins A3, B4, B3, B2, และ D2 จะถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วย ODSMPLC และแยกออกจากกันด้วย preparative ODS-HPLC โดยใช้ AcOH solvent system 

Preparative HPLC มีสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ

Column: Inertsil ODS (20 i.d. x 250 mm)

Flow rate: 7-10 มล./นาที

Solvent system: isocratic elution โดยใช้ส่วนผสมของ solvent A (15% AcOH ในน้ำ) และ solvent B (15% AcOH, 30% MeCN ในน้ำ) อัตราส่วนA : B เท่ากับ 64 : 35 – 90 : 10

Detector: UV–Vis detector ที่ความยาวคลื่น 530 นาโนเมตร

Preparative MPLC (YFLC-540 pump system) มีสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ

Column: YFLC gel column (ODS, 40 ím, 20 i.d. x 300 mm, MM column

Flow rate: 15-20 มล./นาที

Solvent system: A : B เท่ากับ 50 : 50

Detector: บันทึกค่า UV-Vis spectra ด้วย MPS-2000 spectrophotometer ใน 0.01% กรดไฮโดรคลอริกในเมทานอล (HCl-MeOH) 

สารสำคัญที่แยกได้จะถูกพิสูจน์โครงสร้างด้วยเทคนิค fast atom bombardment mass spectrometry (FABMS), 1H- และ13C-nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy

ตัวอย่างที่ 2 การสกัดและแยกสารกลุ่ม anthocyanins จากดอกอัญชันได้แก่ ternatin C1, C2, C3, C4, C5, D3 และ preternatins A3, C4 ทำได้โดยนำดอกอัญชันมาอบแห้งที่อุณหภูมิ 45 oC นาน 1 คืน นำดอกอัญชันแห้ง 25 ก. มาแช่ใน5% AcOH 1 ล. นาน 1 คืน กรอง ทำซ้ำ 3 ครั้ง รวมสารสกัดที่ได้ นำไปวิเคราะห์สารสำคัญด้วย HPLC (L-6200 intelligent pump system) ซึ่งมีสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ (15)

Column: Inertsil ODS-2 (4.6 i.d. x 50 mm + 4.6 i.d. x 250 mm) อุณหภูมิ column 35 OC Flow rate: 1 มล./นาที

Detector: UV–Vis detector ที่ความยาวคลื่น 312 นาโนเมตรสำหรับ UV-absorbing compounds และที่ความยาวคลื่น 530 นาโนเมตรสำหรับสาร anthocyanins

Solvent system: linear gradient elution นาน 45 นาทีจาก 25% ถึง 70% ของ solvent B (1.5% H3PO4, 20% AcOH, 25% MeCN ในน้ำ) ใน solvent A (1.5% H3PO4ในน้ำ)

นำสารสกัดที่ได้ไปเคลือบบน XAD-2000 resin และแยกด้วย column ซึ่งบรรจุ XAD-2000 resin (45 i.d. x 300 mm) ล้างด้วย 1% AcOH 2 ล. และล้าง column (elute) ด้วย 1% AcOH ใน70% เอทานอล1 ล. นำสารที่ได้ไประเหยตัวทำละลายออก จากนั้นนำไปละลายอีกครั้งใน 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)-เอทานอล (6:4) นำไปแยกด้วย column ซึ่งบรรจุ Polyclar AT (45 i.d. x 230 mm) ล้าง column ด้วยตัวทำละลายชนิดเดียวกันซึ่งจะได้ส่วนสกัด 3 ส่วนโดยสาร preternatins A3, C4 , และสาร ternatin A1, A2, A3, C2, C4จะอยู่ในส่วนสกัดที่ 1, สาร ternatin B1, B2, B3, C4, C5จะอยู่ในส่วนสกัดที่ 2, สาร ternatin C1, C3, D1, D2, D3 จะอยู่ในส่วนสกัดที่ 3ส่วนสกัดแต่ละส่วนจะถูกทำให้บริสุทธิ์และแยก 2 ครั้ง โดย preparative ODS-HPLC โดยใช้ AcOH solvent system

Preparative ODS-HPLC มีสภาวะที่ใช้ในการวิเคราะห์ คือ

Column: Inertsil ODS (20 i.d. x 250 mm)

Flow rate: 7-10 มล./นาที

Solvent system: isocratic elution โดยใช้ส่วนผสมของ solvent A (15% AcOH ในน้ำ) และ solvent B (15% AcOH, 30% MeCN ในน้ำ) อัตราส่วนA : B เท่ากับ 63 : 37 – 96 : 4

Detector: UV–Vis detector ที่ความยาวคลื่น 530 นาโนเมตร บันทึกค่า UV-Vis spectra ด้วย MPS-2000 spectrophotometer ใน 0.01% HCl-MeOH

สาร anthocyanins ทั้ง 8 ชนิดจะถูกนำมาระเหยตัวทำละลายออกจนแห้งในภาวะสุญญากาศ จากนั้นจึงนำมาละลายด้วย TFA เล็กน้อย และนำมาทำให้ตกตะกอนด้วยการเติม diethyl ether ซึ่งจะทำให้ได้ TFA salts ของ ternatin C1 (25 มก.), C2 (3 มก.), C3 (11 มก.), C4 (31 มก.), C5 (17 มก.), D3 (3 มก.) และ preternatins A3 (20 มก.), C4 (2 มก.) ซึ่งมีลักษณะเป็นผงสีม่วงแดง (reddish purple powder) สารสำคัญที่แยกได้จะถูกพิสูจน์โครงสร้างด้วยเทคนิค FABMS, 1H- และ 13C-NMR spectroscopy

ตัวอย่างที่ 3 การสกัดและแยกสารกลุ่ม anthocyanins และ flavonol glycosides จากดอกอัญชันสีน้ำเงินสายพันธุ์ Double Blue (8) ทำได้โดยนำดอกที่บานเต็มที่มาอบแห้งที่อุณหภูมิ 50 oC นำดอกอัญชันแห้ง 106 ก. มาปั่นและสกัดด้วย50% เมทานอล–1% TFA 1 ล. โดยทำซ้ำ 3 ครั้ง แยกสารประกอบที่ไม่ชอบน้ำ (hydrophobic compounds) ออกด้วยการสกัดด้วยคลอโรฟอร์มและเอทิลอะซิเตท (ได้สารสกัดคลอโรฟอร์ม 86.3 มก. และสารสกัดเอทิลอะซิเตท 658.2 มก.) ได้สารสกัดหยาบ 83 ก. นำมาแยกด้วย MPLC (Column: LopODS, Solvent system: 20–70% MeCN gradient ในน้ำ) ซึ่งจะได้ส่วนสกัด 2 ส่วน คือส่วนสกัด A (20–70% MeCN fraction) 76 ก. และ ส่วนสกัด B (70% MeCN fraction) 6.0 ก. โดยส่วนสกัด A จะมีสารกลุ่ม anthocyanins และส่วนสกัด B จะมีสารกลุ่ม flavonoid glycosides นำส่วนสกัด B ไปแยกด้วย Sephadex LH-20 column chromatography (5–70% MeCN gradient ในน้ำ ซึ่งจะได้ส่วนสกัด 3 ส่วนคือ ส่วนสกัด C (5–40% MeCN fraction) 1.6 ก., ส่วนสกัด D (40–50% MeCN fraction) 1.5 ก., และส่วนสกัด E (50–70% MeCN fraction) 3.1 ก. ซึ่งส่วนสกัด C จะมีสารกลุ่ม anthocyanins นำส่วนสกัด D และ E ไปแยกด้วย Preparative HPLC (Column: Develosil-10/20 (20 i.d. x 250 mm, Waters 616 LC system + 717 autosampler + 486 UV/Vis detector, Solvent system: 5–40% MeCN–0.01M TFA gradient/0.01 M TFA) ซึ่งส่วนสกัด D จะให้สาร 5 ชนิด ได้แก่ kaempferol 3-O-(2′′-O-α-rhamnosyl-6′′-O-malonyl)-β-glucoside (10.0 มก.), quercetin 3-O-(2′′-O-α-rhamnosyl-6′′-O-malonyl)-β-glucoside (4.0 มก.), myricetin 3-2G-rhamnosylrutinoside (15.8 มก.), quercetin 3-2G-rhamnosylrutinoside (132.9 มก.), kaempferol 3-2G-rhamnosylrutinoside (489.6 มก.) และส่วนสกัด E จะให้สาร 9 ชนิด ได้แก่ kaempferol 3-neohesperidoside (1899.6 มก.), quercetin 3-neohesperidoside (259.7 มก.), myricetin 3-neohesperidoside (16.3 มก.), kaempferol 3-rutinoside (12.8 มก.), quercetin 3-rutinoside (129.8 มก.), myricetin 3-rutinoside (19.3 มก.), kaempferol 3-glucoside (41.9 มก.), quercetin 3- glucoside (35.1 มก.) , myricetin 3-glucoside (7.6 มก.)

นำสารที่ได้มาผ่านกระบวนการ acid hydrolysis โดยนำสารที่แยกได้ 100 มคก. มาละลายในเมทานอล 5 มคล. เติม 2 M HCl 5 มคล. ดูดสารละลายที่ได้ด้วย Ringcaps pipette ขนาด 10 มคล. ปิดให้เรียบร้อย นำไปใส่ใน block heater อุณหภูมิ 100 oC นาน 60 นาที จากนั้นจึงนำออกมาเจือจางด้วยน้ำ 290 มคล. นำไปผ่าน Sep-Pak Vac 1-cc C18 Cartridge และล้าง (rinse) ด้วยน้ำ 300 มคล. 2 ครั้ง นำมารวมกันแล้วแยกเป็น 2 ส่วน ส่วนที่ 1 ล้าง (elute) ด้วยน้ำ 900 มคล. นำไปวิเคราะห์น้ำตาล (sugar) ด้วย HPLC ส่วนที่ 2 ล้าง (elute) ด้วย 40% MeCN–0.01M TFA 1 มล. นำไปวิเคราะห์ flavonoid aglycones ด้วย HPLC

การวิเคราะห์น้ำตาลด้วย HPLC มีสภาวะที่ใช้คือ

Column: Sucrebead I (2 i.d. x 250 mm); อุณหภูมิ 20 oC

Solvent system: solvent, 0.3 M NaOH

Flow rate: 100 มคล./นาที

การวิเคราะห์น้ำ flavonoid aglycones ด้วย HPLC มีสภาวะที่ใช้คือ

Column: Capcell Pak C18 UG 120 (3 i.d. x 250 mm); อุณหภูมิ 50 oC

Solvent system: 40% เมทานอล–0.01M TFA

Flow rate: 500 มคล./นาที

การวิเคราะห์ LC/MS/MS ทำได้โดยการนำดอกอัญชันสดมาปั่นและสกัดด้วย50%เมทานอลที่มี 0.01 M TFA 2 มล. โดยทำซ้ำ 3 ครั้งนำสารสกัดหยาบที่ได้มากระจายตัวในน้ำ และนำไปผ่าน Sep-Pak C18 ล้าง(elute) ด้วย 40% MeCN ในน้ำ ซึ่งมี0.01 M TFA วิเคราะห์สารกลุ่ม anthocyanins ด้วย LC/MS/MS system (Nanospace HPLC system) ซึ่งมีสภาวะที่ใช้คือ

Column: Develosil C30-UG-5 (1.5 i.d. x 250 mm); อุณหภูมิ 35oC

Solvent system: linear gradient ของ14%ถึง86% solvent B (40% MeCN–0.01 M TFA) ใน solvent A (5% MeCN–0.01M TFA) นาน 45 นาที

Flow rate: 125มคล./นาที

Detector: photodiode array (PDA) detector เชื่อมต่อกับ Esquire3000 ion trap mass spectrometer

Result: ternatin C5 (12.2 นาที, m/z 875), delphinidin 3-glucoside (16.3 นาที, m/z 465), ternatin C4 (16.7 นาที, m/z 1183), A3 (17.5 นาที, m/z 1491), B4 (22.5 นาที, m/z 1329), A2, (23.3 นาที, m/z 1021), C3 (23.3 นาที, m/z 1799), C2 (24.1 นาที, m/z 1491), A1 (24.8 นาที, m/z 2107), B3 (25.7 นาที, m/z 1637), D3 (26.7 นาที, m/z 1167), B1 (30.4 นาที, m/z 1637), B2 (30.4 นาที, m/z 1945), C1 (32.0 นาที, m/z 1329), D2 (32.6 นาที, m/z 1475), D1 (34.7 นาที, m/z 1783)

สารสำคัญที่แยกได้ทั้งหมดจะถูกพิสูจน์โครงสร้างด้วยเทคนิค UV, MS, และ NMR spectroscopy

ตัวอย่างที่ 4 การสกัดและแยกสารกลุ่ม anthocyanins ได้แก่ delphinidin 3-O-(6′′-O-malonyl)-β-glucoside, delphinidin 3-O-(2′′-O-α-rhamnosyl-6′′-O-malonyl)-β-glucoside, delphinidin 3-neohesperidoside, delphinidin 3-O-β-glucoside ซึ่งพบได้เฉพาะในดอกอัญชันสีม่วงอ่อน (mauve) (16)  ทำได้โดยนำดอกอัญชันสด 212 ก. มาปั่นและสกัดด้วย 50% เมทานอลที่มี 1% TFA แยกสารประกอบที่ไม่ชอบน้ำ (hydrophobic compounds) ออกด้วยการสกัดด้วยคลอโรฟอร์มและเอทิลอะซิเตท นำสารที่เหลือมาแยกด้วย Sephadex LH-20 column chromatography (20-80% MeCN gradient ในน้ำซึ่งมี 0.05 M TFA) ซึ่งจะได้ส่วนสกัด 5 ส่วน คือส่วนสกัด A ถึง E (5–20, 20–30, 30–36, 36–53 และ 53–80% MeCN fraction ตามลำดับ) โดยส่วนสกัด B และ C จะมีสารในกลุ่ม anthocyanins และ flavonol glycosides, ส่วนสกัด A, D, และ E จะมีสารในกลุ่ม flavonol glycosides และ phenolic substances นำส่วนสกัด B และ C ไปแยกด้วย Preparative HPLC (Column: Develosil-10/20 (20 i.d. x 250 mm, Waters 616 LC system + 717 autosampler + 486 UV/Vis detector, Solvent system: 55–40% MeCN gradient ใน 0.01 M TFA) ซึ่งส่วนสกัด B จะให้สาร 3 ชนิด คือ delphinidin 3-O-(2′′-O-α-rhamnosyl-6′′-O-malonyl)-β-glucoside (8.9 มก.), delphinidin 3-neohesperidoside (4.2 มก.), delphinidin 3-O-β-glucoside (8.5 มก.) และส่วนสกัด C จะให้สาร 2 ชนิด คือ delphinidin 3-O-(6′′-O-malonyl)-β-glucoside (58.1 มก.), delphinidin 3-O-β-glucoside (26.0 มก.)

การวิเคราะห์สารกลุ่ม anthocyanins ด้วย LC/MS/MS system โดยใช้ PerSeptive Biosystems Voyager DE-STR และ ESI-MS Bruker Esquire3000 spectrometer พบสารสำคัญดังนี้ delphinidin 3-neohesperidoside (14.0 นาที; m/z 611 [M+H]+; m/z 303 [M-rhamnosylglucosyl+H]+), delphinidin 3-glucoside (16.6 นาที; m/z 465 [M+H]+; m/z 303 [M-glucosyl+H]+), delphinidin 3-(2′′-rhamnosyl-6′′-malonyl)-glucoside (19.3 นาที; m/z 697 [M+H]+; m/z 653 [M-CO2+H]+, 611 [M-malonyl+H]+, 303 [M-malonyl-rhamnosylglucosyl+H]+), และ delphinidin 3-(6′′-malonyl) glucoside (23.0 นาที; m/z 551 [M+H]+; m/z 303 [M-malonylglucosyl+H]+)

สารสำคัญที่แยกได้ทั้งหมดจะถูกพิสูจน์โครงสร้างด้วยเทคนิค UV, MS, และ NMR spectroscopy

1 การศึกษาเกี่ยวกับผิวหน้า

1.1 ทำให้ผิวหน้าขาว (F001)

การทดสอบฤทธิ์ช่วยให้ผิวหน้าขาวของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) ในรูปแบบของสารละลายน้ำหมักดอกอัญชัน (butterfly pea flower fermentation solution) ซึ่งสามารถเตรียมได้โดย เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ (ประกอบด้วย proteose peptone No.3 10.0 ก./ล., yeast extract 5.0 ก./ล., dextrose 20.0 ก./ล., polysorbate 80 1.0 ก./ล., ammonium citrate 2.0 ก./ล., sodium acetate 5.0 ก./ล., magnesium sulfate 0.1 ก./ล., dipotassium phosphate 2.0 ก./ล.) 1 ล. นำไปฆ่าเชื้อด้วยเครื่อง sterilizer ความดัน 1.2 กก./ตร.ซม. อุณหภูมิ 121 oC นาน 1 ชม. เมื่ออาหารเลี้ยงเชื้ออุณหภูมิลดลงเท่าอุณหภูมิห้อง เติมดอกอัญชัน 50 ก.,sugar-free soy milk 50 ก., actic acid bacteria (Lactobacillus acidophilusATCC 4357) 5 ก., และ deionized water 1 ล. นำไปเข้าเครื่องเขย่า (shaking incubator) ที่ความเร็ว 125 รอบ/นาที อุณหภูมิ 30 oC นาน 48 ชม. นำไปปั่นด้วยเครื่อง centrifuge ความเร็วสูง (ไม่ระบุความเร็ว) นำส่วนใสไปฆ่าเชื้อด้วยเครื่อง sterilizer ความดัน 1.2 กก./ตร.ซม. อุณหภูมิ 121 oC นาน 1 ชม. เมื่ออุณหภูมิลดลงเท่าอุณหภูมิห้องนำไปกรองใน UV disinfection chamberซึ่งจะได้สารละลายน้ำหมักดอกอัญชัน (butterfly pea flower fermentation solution) จากนั้นนำมาสารละลายที่ได้มาเจือจางด้วยน้ำกลั่นจนมีความเข้มข้น 1.0%, 2.5%, 5.0%, 7.5%, และ 10.0% จากนั้นจึงนำไปทดสอบกับอาสาสมัครเพศหญิง (ไม่ระบุจำนวน) อายุ 18-20 ปี โดยแบ่งพื้นที่ทดสอบเป็นด้านขวาและด้านซ้าย (บริเวณหน้าผากและแก้ม) ด้านขวาจะใช้ cleansing mousse ที่มีสารละลายน้ำหมักดอกอัญชัน (experimental area) ส่วนด้านซ้ายจะใช้ cleansing mousse ที่ไม่มีสารละลายน้ำหมักดอกอัญชัน (control area) หลังจากล้างทำความสะอาดทั้งหน้าแล้ว รอ 30 นาที จึงทดสอบ whitening effect ด้วยเครื่อง NF333 spectrophotometerทำการทดสอบนาน 28 วัน พบว่าสารละลายน้ำหมักดอกอัญชันความเข้มข้น 1.0%, 2.5%, 5.0%, 7.5%, และ 10.0% ทำให้ผิวหน้าขาวขึ้น 7.99%, 10.53%, 18.50%, 22.21%, และ 29.97% ตามลำดับ เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม จากนั้นจึงนำมาพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์มาสก์ (brightening mask) ซึ่งมีส่วมผสมของสารละลายน้ำหมักดอกอัญชัน 6% เมื่อนำมาทดสอบกับอาสาสมัครจำนวน 20 คน โดยให้ใช้นาน 30 วัน พบว่าผลิตภัณฑ์ดังกล่าวทำให้ผิวหน้าขาวขึ้น 18.34% เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (29)

1.2 ทำให้ผิวหน้าชุ่มชื้น (F005)

การทดสอบฤทธิ์เพิ่มความชุ่มชื้นให้กับผิวหน้าของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) ในรูปแบบของสารละลายน้ำหมักดอกอัญชัน (butterfly pea flower fermentation solution) ซึ่งสามารถเตรียมได้โดย เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ (ประกอบด้วย proteose peptone No.3 10.0 ก./ล., yeast extract 5.0 ก./ล., dextrose 20.0 ก./ล., polysorbate 80 1.0 ก./ล., ammonium citrate 2.0 ก./ล., sodium acetate 5.0 ก./ล., magnesium sulfate 0.1 ก./ล., dipotassium phosphate 2.0 ก./ล.) 1 ล. นำไปฆ่าเชื้อด้วยเครื่อง sterilizer ความดัน 1.2 กก./ตร.ซม. อุณหภูมิ 121 oC นาน 1 ชม. เมื่ออาหารเลี้ยงเชื้ออุณหภูมิลดลงเท่าอุณหภูมิห้อง เติมดอกอัญชัน 50 ก.,sugar-free soy milk 50 ก., actic acid bacteria (Lactobacillus acidophilusATCC 4357) 5 ก., และ deionized water 1 ล. นำไปเข้าเครื่องเขย่า (shaking incubator) ที่ความเร็ว 125 รอบ/นาที อุณหภูมิ 30 oC นาน 48 ชม. นำไปปั่นด้วยเครื่อง centrifuge ความเร็วสูง (ไม่ระบุความเร็ว) นำส่วนใสไปฆ่าเชื้อด้วยเครื่อง sterilizer ความดัน 1.2 กก./ตร.ซม. อุณหภูมิ 121 oC นาน 1 ชม. เมื่ออุณหภูมิลดลงเท่าอุณหภูมิห้องนำไปกรองใน UV disinfection chamberซึ่งจะได้สารละลายน้ำหมักดอกอัญชัน (butterfly pea flower fermentation solution) จากนั้นนำมาสารละลายที่ได้มาเจือจางด้วยน้ำกลั่นจนมีความเข้มข้น 1.0%, 2.5%, 5.0%, 7.5%, และ 10.0% จากนั้นจึงนำไปทดสอบกับอาสาสมัครเพศหญิง (ไม่ระบุจำนวน) อายุ 18-20 ปี โดยแบ่งพื้นที่ทดสอบเป็นด้านขวาและด้านซ้าย (บริเวณหน้าผากและแก้ม) ด้านขวาจะใช้ cleansing mousse ที่มีสารละลายน้ำหมักดอกอัญชัน (experimental area) ส่วนด้านซ้ายจะใช้ cleansing mousse ที่ไม่มีสารละลายน้ำหมักดอกอัญชัน (control area) หลังจากล้างทำความสะอาดทั้งหน้าแล้ว รอ 30 นาทีจึงวิเคราะห์ผลด้วยวิธี moisture retention assay ด้วยเครื่อง three-in-one skin analyzer (SSC3) ทำการทดสอบนาน 28 วัน พบว่าสารละลายน้ำหมักดอกอัญชันความเข้มข้น 1.0%, 2.5%, 5.0%, 7.5%, และ 10.0% ทำให้ความชุ่มชื้นบนผิวหน้าเพิ่มขึ้น 10.20%, 14.28%, 15.91%, 19.63%, และ 20.32% ตามลำดับ เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม จากนั้นจึงนำมาพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์มาสก์ (brightening mask) ซึ่งมีส่วมผสมของสารละลายน้ำหมักดอกอัญชัน 6% เมื่อนำมาทดสอบกับอาสาสมัครจำนวน 20 คน โดยให้ใช้นาน 30 วัน พบว่าผลิตภัณฑ์ดังกล่าวทำให้ความชุ่มชื้นบนผิวหน้าเพิ่มขึ้น 20.35% เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (29)

2 การศึกษาเกี่ยวกับผิวกาย

2.1 ทำให้ผิวกายชุ่มชื้น (S004)

การศึกษาฤทธิ์เพิ่มความชุ่มชื้นให้ผิวของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันแห้ง 10 ก. มาสกัดด้วย 20% เอทานอล 100 ก. ใน ultrasonic bath ที่อุณหภูมิ 25 oC นาน 20 นาที หลังจากนั้นนำมาทำให้เย็นลงที่อุณหภูมิ 22-23 oC กรอง 3 ครั้ง นำมาระเหยตัวทำละลายออกด้วยการลดความดันที่อุณหภูมิ 40 oC นำมาทดสอบการเพิ่มความชุ่มชื้นให้ผิวด้วยการวัดค่า skin hydration และ transepidermal water loss (TEWL) ในอาสาสมัครจำนวน 15 คน โดยทาสารสกัดต่างๆ ความเข้มข้น 10 มก./มล. ขนาด 0.2 มล. บริเวณท้องแขนของอาสาสมัคร ในขนาดพื้นที่ 2 x 2 ซม. ทิ้งไว้ 30 นาที หลังจากนั้นจึงตรวจวัดระดับความชื้น (hydration level)และค่า TEWL ที่เวลา 60 และ 360 นาที ผลการตรวจวัดระดับความชื้นพบว่าสารสกัดจากดอกอัญชันเพิ่มความชุ่มชื้นให้ผิวได้เพียงเล็กน้อย โดยที่เวลา 360 นาที สามารถเพิ่มความชุ่มชื้นให้ผิวหนังได้ 10% เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม และที่เวลา 60 และ 360 นาทีสารสกัดจากดอกอัญชันสามารถป้องกันการสูญเสียน้ำจากผิวหนังได้ 15% และ 5% ตามลำดับ เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (30)

1 การศึกษาเกี่ยวกับเส้นผมและหนังศีรษะ

1.1 ย้อมสีผม (H003)

การพัฒนาผลิตภัณฑ์ย้อมสีผมจากดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันมาล้างด้วยน้ำสะอาด ผึ่งให้แห้ง นำกลีบดอกมาปั่นกับน้ำบริสุทธิ์โดยใช้เครื่องปั่นน้ำผลไม้ กรองด้วยใช้ผ้าขาวบาง 4 ชั้น นำสารสกัดที่ได้ไปทำให้แห้งโดยใช้เครื่อง freeze-dryer ซึ่งจะได้สารสกัดน้ำของดอกอัญชันในรูปผงแห้ง สำหรับการเตรียมผลิตภัณฑ์เปลี่ยนสีผม จะเตรียมสารสกัดในรูปแบบสารละลาย โดยใช้สารละลายซิเตรตบัฟเฟอร์ pH 5.5 เป็นตัวทำละลาย (สารละลายมีสีน้ำเงินเข้มและมีความคงตัวเมื่อเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4oC และในสภาวะป้องกันแสง)ทำการประเมินผลโดยจุ่มตัวอย่างเส้นผมน้ำหนัก 150 มก.ที่มัดเป็นกลุ่มลงในสารละลายสีดอกอัญชันที่ความเข้มข้นต่าง ๆ นาน 24 ชม. ทิ้งไว้ให้แห้งในอากาศ ล้างตัวอย่างผมด้วยน้ำสะอาดไหลผ่านเป็นเวลา 1 นาที ทิ้งไว้ให้แห้งในอากาศ ประเมินสีของตัวอย่างผมและสภาพเส้นผมเมื่อใช้สีดอกอัญชันที่ความเข้มข้นต่าง ๆ เปรียบเทียบกับเส้นผมที่จุ่มในสารละลายบัฟเฟอร์ สังเกตลักษณะเส้นผมและบันทึกภาพโดยใช้กล้องถ่ายรูปและเครื่องวิเคราะห์สภาพเส้นผม (I-Scope for hair and scalp, Japan) และประเมินความเข้มสีของตัวอย่างผมโดยการวัด melanin value ด้วยเครื่อง Cutometer MPA 580 (Germany) พบว่า ความเข้มข้นที่เหมาะสมของสารสกัดดอกอัญชันคือ 5 %w/v และการใช้สารเติมแต่งหลายชนิดจะช่วยส่งเสริมการย้อมสีผมของอัญชัน เช่น สารละลายซิเตรตบัฟเฟอร์ pH 5.5 ใช้เป็นสารเพิ่มความคงตัว, aloe ในช่วงความเข้มข้น 0.125-0.25 %w/v มีคุณสมบัติเป็นสารที่ทำให้สีอัญชันย้อมติดผมดีขึ้นและเป็นสารให้ความชุ่มชื้น, chitosan ในช่วงความเข้มข้น 0.125-1 %w/v และ chitosan nanoparticles ที่ความเข้มข้น 0.04 %w/v มีคุณสมบัติเป็นสารที่ทำให้สีอัญชันย้อมติดผมดีขึ้นและสารเป็นให้ความชุ่มชื้น ผลิตภัณฑ์เปลี่ยนสีผมที่มีส่วนผสมของสารสกัดดอกอัญชันความเข้มข้น 5 %w/v และ chitosan ความเข้มข้น 0.5 %w/v มีคุณสมบัติการย้อมสีผมได้ดีที่สุด คือ สีย้อมติดบนตัวอย่างผมเข้มที่สุดและลักษณะผมหลังย้อมมีความนุ่มสลวย อย่างไรก็ตาม หลังการสระผมครั้งแรกความเข้มของสีย้อมบนเส้นผมจะลดลงอย่างมีนัยสำคัญ แสดงให้เห็นว่า สารสกัดน้ำจากดอกอัญชันอาจมีศักยภาพในการพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์เปลี่ยนสีผม (31)

การทดสอบความสามารถในการย้อมผมของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำผงดอกอัญชันแห้ง 500 ก. มาสกัดด้วยวิธีแช่สกัด (maceration) โดยใช้ 70% เอทานอลเป็นตัวทำละลาย เป็นเวลานาน 4 คืน กรอง และระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary evaporator ที่อุณหภูมิ 45 oC จากนั้นนำสารสกัดด้งกล่าวมาทดสอบฤทธิ์กระตุ้นเอนไซม์ tyrosinase และทดสอบฤทธิ์กระตุ้นการแบ่งตัวของเซลล์สร้างเม็ดสี (melanocyte) ด้วยวิธี MTT assay ในเซลล์melanoma ชนิด B16F10 ของหนูเม้าส์ พบว่าสารสกัด 70% เอทานอลของดอกอัญชันความเข้มข้น 50 มก./มล. สามารถกระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ tyrosinase ได้มากกว่า 80% และสารสกัด 70% เอทานอลของดอกอัญชันความเข้มข้น 50-500 มคก./มล. สามารถกระตุ้นการแบ่งตัวของเซลล์สร้างเม็ดสีได้ดี และทำให้ค่า proliferation index เพิ่มขึ้น จาก 1.2 เป็น 1.5 เมื่อความเข้มข้นที่ใช้เพิ่มขึ้นแสดงให้เห็นว่า สารสกัด 70% เอทานอลของดอกอัญชันอาจใช้เป็นส่วนประกอบในผลิตภัณฑ์ย้อมสีผมได้ (32)

1.2 ฤทธิ์ยับยั้งการหลุดร่วงของเส้นผม (H004)

การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการหลุดร่วงของเส้นผมของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันมาทำความสะอาด ลดขนาด อบแห้งที่อุณหภูมิไม่เกิน 45 oC สกัดด้วยวิธีแช่สกัดด้วยน้ำหรือเอทานอล โดยทำการสกัด 3 รอบ รอบละ 3 วัน รวมสารสกัดที่ได้และระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary evaporator นำสารสกัดที่ได้ไปทดสอบฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ 5α-reductase ในหลอดทดลองพบว่าสารสกัดน้ำและสารสกัดเอทานอลของดอกอัญชันที่ความเข้มข้น 0.1 มก./มล. สามารถยับยั้งเอนไซม์ 5α-reductase ได้ 53.86% และ 83.27% ตามลำดับ ขณะที่สารมาตรฐาน finasteride มีค่าความเข้มข้นที่สามารถยับยั้งได้ครึ่งหนึ่ง (IC50) เท่ากับ 0.39 ไมโครโมลาร์ (33)

การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการหลุดร่วงของเส้นผมของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันมาอบให้แห้งที่อุณหภูมิ 45 oC บดให้ละเอียด สกัดด้วยวิธีแช่สกัดโดยใช้ 95% เอทานอลเป็นตัวทำละลาย กรอง และทำให้แห้งด้วยเครื่อง rotary evaporator นำสารสกัดที่ได้มาทดสอบฤทธ์ยับยั้งเอนไซม์ 5α-reductase ในเซลล์ตับของหนูแรท (5α-reductase assay) พบว่าสารสกัด 95% เอทานอลของดอกอัญชัน 1 กรัมสามารถยับยั้งเอนไซม์ 5α-reductase ได้เทียบเท่ากับยามาตรฐาน finasteride 15.39 มก. (mg finasteride/1 g crude extract) ซึ่งยา finasteride มีค่า IC50 0.39 ไมโครโมลาร์ (34)

1.3 ฤทธิ์กระตุ้นการงอกของเส้นผม (H005)

การทดสอบฤทธิ์กระตุ้นการงอกของเส้นผมของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันมาอบให้แห้งที่อุณหภูมิ 45 oC บดให้ละเอียด สกัดด้วยวิธีแช่สกัด โดยใช้ 95% เอทานอลเป็นตัวทำละลาย กรอง และทำให้แห้งด้วยเครื่อง rotary evaporator นำสารสกัดที่ได้มาทดสอบฤทธิ์กระตุ้นการงอกของเส้นผมในหนูแรท โดยแบ่งหนู่เป็น 3 กลุ่ม ซึ่งหนูจะถูกกำจัดขนบนผิวหนังบริเวณหลังด้วยการทาครีมกำจัดขน ขนาดพื้นที่ 2 ซม. X 3 ซม. และในวันต่อมาบริเวณดังกล่าวจะถูกทาด้วยสารทดสอบขนาด 100 มคล. โดยกลุ่มที่ 1 ทาน้ำกระสายยา กลุ่มที่ 2 ทายามาตรฐาน minoxidil ความเข้มข้น 2% และกลุ่มที่ 3 ทาสารสกัดดอกอัญชันความเข้มข้น 1%w/w ทำการทดสอบนาน 28 วัน พบว่าหนูที่ทาสารสกัดดอกอัญชันมีขนยาวกว่าหนูที่ทายา minoxidil และการวิเคราะห์เนื้อเยื่อบริเวณดังกล่าวด้วยกล้องจุลทรรศน์กำลังขยาย 100 เท่าพบว่า บริเวณที่ทาสารสกัดดอกอัญชันมีจำนวนเซลล์รากผม (hair follicle) เพิ่มขึ้น โดยมีจำนวนเซลล์รากผม 52.5 เซลล์/พื้นที่ ส่วนบริเวณที่ทายา minoxidil มีจำนวนเซลล์รากผม 36.3 เซลล์/พื้นที่ แสดงให้เห็นว่า สารสกัด 95% เอทานอลของดอกอัญชันมีฤทธิ์กระตุ้นการงอกของเส้นผม (34)

การพัฒนาผลิตภัณฑ์กระตุ้นการงอกของเส้นผมจากดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันมาล้างด้วยน้ำสะอาด ผึ่งให้แห้ง นำกลีบดอกมาปั่นกับน้ำบริสุทธิ์โดยใช้เครื่องปั่นน้ำผลไม้ กรองด้วยใช้ผ้าขาวบาง 4 ชั้น นำสารสกัดที่ได้ไปทำให้แห้งโดยใช้เครื่อง freeze-dryer ซึ่งจะได้สารสกัดน้ำของดอกอัญชันในรูปผงแห้ง สำหรับการเตรียมผลิตภัณฑ์กระตุ้นการงอกของเส้นผมจะเตรียมสารสกัดในรูปแบบลิโปโซมโดยใช้อัตราส่วนโดยน้ำหนักของ phosphatidylcholine, Tween 80 และ สารสกัดดอกอัญชัน เท่ากับ 1 : 0.2 : 0.75 (ลิโปโซมที่ได้มีขนาด 170 nm ศักย์ซีต้า -10 mV และบรรจุสารสกัดดอกอัญชันได้ 57%) การทดสอบฤทธิ์กระตุ้นการงอกของเส้นผมของผลิตภัณฑ์ในรูปแบบโลชันที่มีส่วนผสมของสารสกัดดอกอัญชันความเข้มข้น 1 %w/v ในรูปลิโปโซมในหนูเม้าส์ที่โกนขนบริเวณด้านหลังออก ขนาด 2 ซม. X 3 ซม. โดยทาสารทดสอบ 100 มคล. วันละครั้งทุกวันในเวลาเดียวกัน ต่อเนื่องกันเป็นเวลา 4 สัปดาห์ สังเกตการงอกของขนและการระคายเคืองต่อผิวหนัง ทำการวัดความยาวขนทุกสัปดาห์ภายหลังการทาผลิตภัณฑ์ และให้คะแนนการงอกของขนบนพื้นที่ที่ทดสอบในระดับ 0-5 คะแนน โดย 0=ไม่เห็นขนงอก, 1=ขนงอกน้อยกว่า 20%, 2= ขนงอก 20-40%, 3= ขนงอก 40-60%, 4= ขนงอก 60-80%, 5= ขนงอก 80-100% เมื่อครบ 4 สัปดาห์ ทำการดึงขนจากบริเวณที่ทดสอบ 10 เส้น วัดความยาวของขนโดยใช้เวอร์เนีย วัดความหนาของขน ขนาดกระเปาะขน (hair bulb) และนับจำนวนปุ่มรากขน (hair follicle) ในเนื้อเยื่อผิวหนังหนูที่ได้รับการย้อมสี hematoxylin และ eosin โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ พบว่า ผลิตภัณฑ์ดังกล่าวสามารถกระตุ้นการงอกของขนได้ดีกว่าการใช้ยา minoxidil ความเข้มข้น 2 %w/v และกลุ่มควบคุม ในทุกตัวชี้วัด และไม่พบการระคายเคืองในสัตว์ทดลอง แสดงให้เห็นว่า สารสกัดน้ำจากดอกอัญชันอาจมีศักยภาพในการพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์กระตุ้นการงอกของเส้นผม (31)

2 การศึกษาเกี่ยวกับผิวกาย

2.1 ฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย (S005)

การทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย S.aureus ของดอกอัญชันจากประเทศมาเลเซีย (voucher specimen: 11006) โดยนำผงแห้งของดอกอัญชันมาสกัดด้วยวิธีแช่สกัดในเมทานอล และมีการคน(under stirring conditions) นาน 3 วัน กรอง ระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary evaporator จากนั้นนำมาทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อ S. aureus ด้วยวิธีdisk diffusion assay โดยใช้สารสกัดความเข้มข้น 100 มก./มล. ในขนาด 25 มคล./diskรวมทั้งทดสอบหาความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถยับยั้งเชื้อได้ (minimum inhibitory concentration; MIC) และความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถฆ่าเชื้อได้ (minimum bactericidal; MBC) ด้วยวิธี broth dilution methods พบว่าสารสกัดเมทานอลของดอกอัญชันมีค่าเฉลี่ยของ inhibition zone ต่อเชื้อ S. aureusเท่ากับ 13 มม. (ยามาตรฐาน chloramphenicol และ levofloxacin ความเข้มข้น 30 มคก./มล. มีค่าเฉลี่ยของ inhibition zone เท่ากับ 19.6 และ 25.7 มม. ตามลำดับ) มีค่า MIC และ MBC มากกว่า 100 มก./มล. (ยา chloramphenicol มีค่า MIC และ MBC มากกว่า 1,000 มคก./มล. ส่วนยา levofloxacin มีค่า MIC และ MBC 31.25 และ 62.5 มคก./มล.ตามลำดับ (35)

การทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย S. aureus ของดอกอัญชันจากประเทศอินเดีย (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันมาล้างให้สะอาด ผึ่งลมให้แห้ง ที่อุณหภูมิห้อง นาน 4 วัน บดให้ละเอียด ชั่งผงดอกอัญชันแห้ง 5, 10, 25, และ 50 ก. เติมน้ำกลั่น 100 มล. คนให้เข้ากัน ตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิ 4 oC นาน 48 ชม. กรอง ซึ่งจะได้สารสกัดน้ำของดอกอัญชันความเข้มข้น 5, 10, 25, และ50%w/v ตามลำดับ นำมาทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อ S. aureus(MTCC No 447)ด้วยวิธีagar well diffusion method โดยใช้สารสกัดทุกความเข้มข้นขนาด 100 มคล. พบว่า สารสกัดน้ำของดอกอัญชันความเข้มข้น 5, 10, 25, และ 50%w/v มีค่าเฉลี่ยของ inhibition zone เท่ากับ 6, 7, 8, และ 10 มม. ตามลำดับ (36)

การทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียสารสำคัญและสารสกัดดอกอัญชันจากประเทศอินเดีย (voucher specimen: GACBOT-121) โดยนำดอกอัญชันมาผึ่งให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง นำดอกแห้ง 750 ก. มาสกัดโดยการแช่ใน 95% เมทานอล 3 ล. ที่อุณหภูมิห้อง นาน 4 วัน โดยมีการกวนเป็นครั้งคราว กรอง ระเหยตัวทำละลายออกโดยการตั้งบน water bath อุณหภูมิ 45 oC และทำให้แห้งด้วยการลดความดัน ซึ่งจะได้สารสกัดเมทานอล นำสารสกัดที่ได้มาสกัดแยกส่วน(sequential partition fraction) ด้วยปิโตรเลียมอีเทอร์, คลอโรฟอร์ม, และเอทิลอะซิเตท จากนั้นจึงนำส่วนสกัดคลอโรฟอร์มมาแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟี และพิสูจน์โครงสร้างด้วยเทคนิคUV, IR, 1H NMR, 13C NMR, และ GC-MS spectroscopic จะทำให้ได้สาร3-deoxy-3, 11-epoxy cephalotaxine ซึ่งเป็นสารในกลุ่มอัลคาลอยด์ นำสารสกัดเมทานอล และสาร3-deoxy-3, 11-epoxy cephalotaxine มาทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียS. aureus ด้วยวิธี disc diffusion method โดยใช้สารสกัดเมทานอลขนาด 150 มก./มล. และสาร3-deoxy-3, 11-epoxy cephalotaxine ขนาด 50 และ 100 มก./มล. จากผลการทดลองพบว่าสารทดสอบมีค่า inhibitionzone เท่ากับ 8, 11, และ 12 มม. ตามลำดับ ในขณะที่ยามาตรฐาน ciprofloxacin ขนาด 20 มก./มล. มีค่า inhibitionzone เท่ากับ 17 มม. (19, 37)

2.2 ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ (S006)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชันจากจังหวัดปราจีนบุรี (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันมาผึ่งลมให้แห้งที่อุณหภูมิ37 oC นำดอกแห้ง 200 ก. มาสกัดด้วยวิธีแช่สกัดโดยใช้น้ำกลั่นหรือ 95% เอทานอล 100 มล. เป็นตัวทำละลาย นำไปเขย่าโดยใส่ในเครื่องเขย่าอัตโนมัติ ความเร็ว 250 รอบ/นาที ที่อุณหภูมิ 37 oC นาน 15 นาที กรอง และระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary vacuum evaporator ซึ่งจะได้สารสกัดน้ำและสารสกัด 95% เอทานอลของดอกอัญชันนำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) assay พบว่า สารสกัดน้ำและสารสกัด 95% เอทานอลของดอกอัญชันมีค่าความเข้มข้นที่สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ครึงหนึ่ง (IC50)  เท่ากับ 1 และ 4 มก./มล. ตามลำดับ จึงนำสารสกัดน้ำซึ่งมีฤทธิ์ดีกว่า มาเตรียมเป็นผลิตภัณฑ์เจลทารอบดวงตา (eye gel) ซึ่งมีส่วนประกอบคือ Carbopol 940 ขนาด 0.8 ก., น้ำกลั่น 40 มล.,triethanolamine 2 มล., สารสกัดน้ำจากดอกอัญชันความเข้มข้น 2 มก./มล. ขนาด 30 มล., กรดซิตริก 0.9 ก.,disodium EDTA 0.01 ก., พาราเบนเข้มข้น (concentrated paraben) 0.2 ก., และโพรพีลีนไกลคอล 15 ก. และปรับให้เป็น 100 ก. ด้วยน้ำบริสุทธิ์ นำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay พบว่าที่ความเข้มข้นของสารสกัดเท่ากับ 0.25 มก./มล. สารสกัดน้ำของดอกอัญชันและ eye gel สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ 32% และ 28% ตามลำดับ และที่ความเข้มข้นของสารสกัดเท่ากับ 0.5 มก./มล. สารสกัดน้ำของดอกอัญชันและ eye gel สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ 34% เท่ากัน อย่างไรก็ตาม ผลิตภัณฑ์eye gel ดังกล่าว ยังมีประสิทธิภาพน้อยกว่าครีมมาตรฐานที่นำมาทดสอบ (commercial eye antiwrinkle firming cream) โดยครีมมาตรฐานขนาด 0.1 มก./มล. สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ 93% ส่วนผลิตภัณฑ์eye gel ขนาด 0.1 มก./มล. สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้เพียง 9% (38)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชันสีน้ำเงินจากประเทศอินเดีย (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันมาสกัดด้วยกรดไฮโดรคลอริก 1%v/v ในเมทานอล (0.1% HCl (v/v) in methanol) (ไม่ระบุวิธีการสกัด) นาน 2-3 ชม. ที่อุณหภูมิห้องและมืด กรอง และล้างกากด้วย กรดไฮโดรคลอริก 1%v/v ในเมทานอล จนสารละลายใส ระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary evaporator ที่อุณหภูมิ 30oC นำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay พบว่าที่เวลา 20 นาที สารสกัดดอกอัญชันความเข้มข้น 0.25 มก./มล. สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ 86±0.44% (23)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชันสีม่วง (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันสีม่วงแบบสด 3 กก. มาสกัดด้วยน้ำกลั่น 2 ล. โดยใช้ homogenizer และเก็บค้างคืนไว้ที่อุณหภูมิ 4 oC กรอง และปั่นด้วยเครื่อง centrifuge ความเร็ว 3,000 รอบ/นาที นาน 15 นาที เก็บเฉพาะส่วนใสมาทำให้แห้งด้วยเครื่อง freeze dryer นำไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay และ ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay การทดสอบด้วยวิธี DPPH assay พบว่า สารสกัดน้ำของดอกอัญชันมีค่า IC50เท่ากับ 85.26 มคก./มล. (สารมาตรฐานวิตามินซีมีค่า IC50เท่ากับ 5.02 มคก./มล.)  และการทดสอบด้วยวิธี FRAP assay พบว่า สารสกัดน้ำของดอกอัญชันมีค่า FRAP value เท่ากับ 0.33 มิลลิโมลาร์(สารมาตรฐานวิตามินซีมีค่า FRAP value เท่ากับ 0.44 มิลลิโมลาร์) (39)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชันสีน้ำเงินจากประเทศมาเลเซีย (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันมาผสมกับซิเตรทบัฟเฟอร์ (citrate buffer) (pH 3.0) 100 มิลลิโมลาร์นาน10 นาที อุณหภูมิ 100 oC โดยใช้อัตราส่วนสมุนไพรต่อบัฟเฟอร์ เท่ากับ1:4 โดยปริมาตรจากนั้นจึงนำมากรอง และระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary evaporator อุณหภูมิ 60 oC ความดัน 114 มิลลิบาร์นำสารสกัดที่ได้ไปแช่แข็ง และเก็บรักษาที่ อุณหภูมิ -20 oC จากนั้นนำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH และ FRAP assay การทดสอบด้วยวิธี DPPH assay พบว่าสารสกัดดอกอัญชันมีค่า EC50เท่ากับ  0.49 ±0.01 มก./มล. ในขณะที่สารมาตรฐาน ascorbic acid และ BHA/BHT มีค่า EC50เท่ากับ0.12 และ 0.10 มก./มล. ตามลำดับ และการทดสอบด้วยวิธี FRAP assay พบว่า สารสกัดดอกอัญชัน 1 ก. มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระได้เทียบเท่ากับสารมาตรฐาน trolox (trolox equivalent antioxidant capacity; TEAC) 13.32 ±0.28 มิลลิโมลาร์ (mM TE/g) (40)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันแห้ง 0.5 กก. มาต้มกับน้ำกลั่น 3 ล. นาน 2 ชม. กรอง และนำมาทำให้แห้งด้วยเครื่อง spray dryer นำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay และ oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay การทดสอบด้วย DPPH assay พบว่าสารสกัดน้ำของดอกอัญชันมีค่า IC50เท่ากับ 0.47 มก./มล. (สารมาตรฐาน ascorbic acid มีค่า IC50เท่ากับ 0.002 มก./มล.) และการทดสอบด้วย ORAC assay พบว่าสารสกัดน้ำของดอกอัญชัน 1 มก. มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเทียบเท่าสารมาตรฐาน trolox 17.54 มคก. (μg trolox equivalents/mg dried extract) (41)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชันสีน้ำเงินจากประเทศอินเดีย (voucher specimen: GACBOT - 121) โดยนำดอกอัญชันแห้ง 750 ก. มาสกัดด้วย 95% เมทานอล 2 ล. จำนวน 3 ครั้ง ครั้งละ 6 วัน ที่อุณหภูมิห้อง (30 ± 2 oC) รวมสารสกัดที่ได้ และระเหยตัวทำละลายออกด้วยการลดความดัน ซึ่งจะได้สารสกัดหยาบเมทานอล 30.7 ก. นำกากที่เหลือนำไปกระจายตัวในน้ำร้อน 1 ล. และนำไปสกัดแยกส่วนด้วยคลอโรฟอร์มและเอทิลอะซิเตท ซึ่งจะได้สารสกัดหยาบคลอโรฟอร์ม 27.0 ก. และสารสกัดหยาบเอทิลอะซิเตท 24.5 ก.จากนั้นนำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay พบว่า ที่ความเข้มข้น 1 มก./มล. สารสกัดเมทานอล, สารสกัดคลอโรฟอร์ม และสารสกัดเอทิลอะซิเตท สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ 85.27%, 92.46%, และ 88.79% ตามลำดับ ในขณะที่สารมาตรฐาน L-ascorbic acid ที่ความเข้มข้นเดียวกันสามารถยับยั้งได้ 99.05% (42)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันแห้ง 300 ก. มาสกัดด้วยน้ำกลั่น 1ล. อุณหภูมิ 95oC นาน 2 ชม. กรอง นำไปทำให้แห้งด้วยเครื่อง spray dryer จากนั้นนำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay, trolox equivalent antioxidant capacity assay (TEAC), FRAP assay, hydroxyl radical scavenging activity (HRSA), superoxide radical scavenging activity (SRSA), และ ferrous ion chelating power (FICP) ซึ่งการทดสอบด้วย DPPH assay พบว่าสารสกัดดอกอัญชันมีค่า IC50เท่ากับ0.467มก./มล. ในขณะที่สารมาตรฐาน ascorbic acid มีค่า IC50เท่ากับ0.002 มก./มล.การทดสอบด้วย TEAC พบว่าสารสกัดดอกอัญชันแห้ง 1 มก. มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระได้เทียบเท่ากับสารมาตรฐาน trolox 0.17 (mg trolox/mg) การทดสอบด้วย FRAP assay พบว่าสารสกัดดอกอัญชันแห้ง 1 มก. มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระได้เทียบเท่ากับสารมาตรฐาน FeSO4 0.38 มิลลิโมล (mmol FeSO4/mg) การทดสอบด้วย HRSA พบว่าสารสกัดดอกอัญชันมีค่า IC50เท่ากับ 19.18 มก./มล. ในขณะที่สารมาตรฐาน trolox มีค่า IC50เท่ากับ 2.03 มก./มล. การทดสอบด้วย SRSA พบว่าสารสกัดดอกอัญชันมีค่า IC50เท่ากับ26.31มก./มล. ในขณะที่สารมาตรฐาน trolox มีค่า IC50เท่ากับ 0.57 มก./มล.และการทดสอบด้วย FICP พบว่าสารสกัดดอกอัญชันแห้ง 1 มก. มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระได้เทียบเท่ากับสารมาตรฐาน EDTA >103มก. (mg EDTA/mg) (43)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชันจากประเทศมาเลเซีย (voucher specimen: SK 2108/13) โดยนำดอกอัญชันมากวนกับน้ำกลั่นอุณหภูมิ 100 oC นาน 10 นาที อัตราส่วนสมุนไพรต่อน้ำ คือ 1: 4 โดยปริมาตรจากนั้นจึงนำมากรอง และระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary evaporator ที่อุณหภูมิ 60 oC ความดัน 114 มิลลิบาร์นำสารสกัดที่ได้ไปแช่แข็ง และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ -20 oC จากนั้นนำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) assay, DPPH assay, FRAP assay, และ ORAC assay ซึ่งการทดสอบด้วย ABTS assay พบว่าสารสกัด 1 ก. มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเทียบเท่ากับสารมาตรฐาน trolox 4.16 ± 0.12 ไมโครโมลาร์  (μM TEAC/g of FEW) การทดสอบด้วย DPPH assay พบว่าสารสกัดมีค่าEC50 เท่ากับ 0.76 มก./มล. ในขณะที่สารมาตรฐาน ascorbic acid มีค่า EC50 เท่ากับ 0.12 มก./มล.การทดสอบด้วย FRAP assay พบว่าสารสกัด 1 ก. มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเทียบเท่ากับสารมาตรฐาน trolox 10.91 ± 0.60มิลลิโมลาร์ (mM TEAC/g FEW) และการทดสอบด้วย ORAC assay พบว่าสารสกัด 1 ก. มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเทียบเท่ากับสารมาตรฐาน trolox 15.76 ± 2.02ไมโครโมล(μmol TEAC/g FEW) เมื่อ FEW = fresh extract weight และ TEAC = trolox equivalent antioxidant capacity (44)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มา, voucher specimen: CT/NNAZ/001) โดยนำผงแห้งของดอกอัญชัน 50 ก. มาสกัดในน้ำที่เพิ่งต้มเดือดใหม่ ๆ (freshly boiled deionized water) 500 มล. นาน 30 นาที รอให้เย็นและเขย่าบ่อย ๆ จากนั้นจึงนำไปสกัดด้วยคลื่นเสียงความถี่สูง นาน 15 นาที กรอง 3 ครั้ง นำไปทำให้แห้งด้วยความเย็น (freeze-dried) จากนั้นนำไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay และ ABTS assay พบว่าสารสกัดน้ำของดอกอัญชันมีค่า IC50เท่ากับ 195.5 และ 42.9 มคก./มล. ตามลำดับ ในขณะที่สารมาตรฐาน trolox มีค่า IC50เท่ากับ 3.32 และ 6.51 มคก./มล. ตามลำดับ (45)

การทดสอบฤทธิ์ปกป้องเซลล์จากอนุมูลอิสระของดอกอัญชันจากประเทศไทย (voucher specimen: CT/NNAZ/001) โดยนำผงแห้งของดอกอัญชัน 50 ก. มาสกัดในน้ำที่เพิ่งต้มเดือดใหม่ ๆ (freshly boiled deionized water) 500 มล. นาน 30 นาที รอให้เย็นและเขย่าบ่อย ๆ จากนั้นจึงนำไปสกัดด้วยคลื่นเสียงความถี่สูง นาน 15 นาที กรอง 3 ครั้ง นำไปทำให้แห้งด้วยความเย็น (freeze-dried) นำไปทดสอบฤทธิ์ปกป้องเซลล์จากอนุมูลอิสระด้วยวิธี hydrogen peroxide (H2O2) induced-cytotoxicity assay ในเซลล์ผิวหนังของมนุษย์ (human keratinocytes; HaCaT) พบว่าสารกัดน้ำจากดอกอัญชันความเข้มข้น 100, 250, และ 500 มคก./มล. สามารถลดความเป็นพิษต่อเซลล์ของ H2O2 ได้ โดยทำให้จำนวนเซลล์ที่รอดชีวิตเพิ่มขึ้น 10-20% (45)

การศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชัน 50 ก.มาสับให้ละเอียด ใส่ลงในขวดรูปชมพู่ เติม 95% เอทานอล 100 มล.เขย่าด้วยเครื่องที่ความเร็ว 200 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิ 37 oC นาน 24 ชม. กรองและสกัดซ้ำอีกครั้ง รวมสารสกัดที่ได้ นำไประเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง rotary evaporator นำไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay และ ABTS assayพบว่า สารสกัดความเข้มข้น 10 มก./มล. สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระในการทดสอบด้วยวิธี DPPH และ ABTS assay ได้ 18.79 % และ 49.92 % ตามลำดับ (46)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและvoucher specimen) โดยการนำดอกอัญชันมาทำความสะอาด แยกเฉพาะส่วนกลีบดอกมา 1 ก. บดกับน้ำกลั่นหรือเอทานอล 10 มล. นำไปปั่นด้วยเครื่อง centrifuge ความเร็ว10,000xg นาน10 นาที ที่อุณหภูมิ4°C กรอง และนำไประเหยแห้ง จากนั้นนำสารสกัดน้ำและสารสกัดเอทานอลความเข้มข้น 100 มคก./มล.ไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธีDPPH assay, reducing power assay, และ thiobarbituric acid (TBA)method ซึ่งการทดสอบด้วยวิธีDPPH assay พบว่าสารสกัดน้ำและสารสกัดเอทานอลสามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ 88.94% และ 90.29% ตามลำดับ การทดสอบด้วยวิธี reducing power assay พบว่าสารสกัดน้ำและสารสกัดเอทานอลมีค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 700 นาโนเมตร เท่ากับ 0.5 และ 0.28 ตามลำดับ การทดสอบด้วยวิธี TBAmethod พบว่าสารสกัดน้ำและสารสกัดเอทานอลสามารถยับยั้งการออกซิเดชันของไขมัน (lipid peroxidation) ได้ 12.5% และ 31.25% ตามลำดับ (47)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชันจากประเทศจีน (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันแห้งมาบดให้ละเอียด ทำการสกัด 2 วิธี วิธีที่ 1 สกัดโดยใช้น้ำกลั่นที่กลั่น 2 ครั้ง (double distilled water) ด้วยการใช้คลื่นเสียงความถี่สูง (ultrasonic extraction) ด้วยเครื่อง Vibra cell crusher (70% amplitude, 240 W, 20 kHz เปิด 3วินาทีและปิด 3 วินาที) ที่อุณหภูมิ 50 oC นาน 150 นาที อัตราส่วนสมุนไพร 1 ก. ต่อตัวทำละลาย 15 มล. เมื่อครบเวลา นำสารไปได้ไปปั่นด้วยเครื่อง centrifuge ด้วยความเร็ว10,000g นาน 5 นาที กรอง ได้สารสกัด US วิธีที่ 2 นำผงอัญชันมาเติมน้ำ (อัตราส่วนสมุนไพร 1 ก. ต่อตัวทำละลาย 15 มล.) แล้วตั้งบน water bath ที่อุณหภูมิ 50 oC นาน 150 นาที เมื่อครบเวลา นำสารไปได้ไปปั่นด้วยเครื่อง centrifuge ด้วยความเร็ว10,000xg นาน 5 นาที กรอง ได้สารสกัด AGE และนำไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay, ABTS assay, FRAP assay, reducing power assay, Cu2+ reducing power ability และ H2O2scavenging activityการทดสอบด้วยวิธี DPPH assay พบว่าสารสกัด US และ AGE แห้ง 1 ก.มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเทียบเท่าสารมาตรฐาน trolox 931.46 และ 764.32 มคก. (μg trolox/g DW) ตามลำดับ การทดสอบด้วยวิธี ABTS assay พบว่าสารสกัด US และ AGE มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเท่ากับ 13,488  และ 11,720.33 μg trolox/g DW ตามลำดับ การทดสอบด้วยวิธี FRAP assayพบว่าสารสกัด US และ AGE มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ 5,834.59 และ 4,195.29 μg trolox/g DW ตามลำดับ การทดสอบด้วยวิธี reducing power assay พบว่าสารสกัด US และ AGE มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ 4,538.97 และ 6,154.10 μg trolox/g DW ตามลำดับ การทดสอบด้วยวิธี Cu2+ reducing power ability พบว่าสารสกัด US และ AGE มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ12,696.31และ 9,548.67 μg trolox/g DW ตามลำดับ และการทดสอบด้วยวิธี H2O2 scavenging activity พบว่าสารสกัด US และ AGE มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ 13.09% และ 12.26% ตามลำดับ ซึ่งการทดสอบส่วนใหญ่พบว่า สารสกัดที่ได้จากการสกัดด้วยคลื่นเสียงความถี่สูง(US) มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดีกว่าการสกัดด้วยการตั้งบน water bath(AGE) ซึ่งเป็นวิธีที่ใช้โดยทั่วไป(conventional extraction) (28)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและvoucher specimen) โดยนำมาล้างทำความสะอาด อบให้แห้งที่อุณหภูมิ 50 oC นาน 24 ชม.บดให้ละเอียด นำสมุนไพร 2 ก. มาสกัดด้วยตัวทำละลาย 3 ชนิด คือ น้ำกลั่น, เมทานอล, และ 50% เมทานอล โดยใช้ปริมาตร 4 มล. ผสมให้เข้ากันด้วยเครื่อง vortex นาน 30 วินาที แช่ทิ้งไว้นาน 6, 12, และ 24 ชม. เมื่อครบเวลา นำมาตั้งบน water bath อุณหภูมิ 60 oC นาน 20 นาที นำไปปั่นด้วยเครื่อง centrifuge ความเร็ว1792 rcf (g) นาน 20 นาที นำส่วนใสไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay พบว่าสารสกัด 50% เมทานอลที่ใช้เวลาในการสกัด 6 ชม. มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดีที่สุด ซึ่งสารสกัดแห้ง 1 ก. มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเทียบเทีบกับสารมาตรฐาน trolox 12.2 มิลลิโมลาร์ (mM trolox/g dry basis petal)(27)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและvoucher specimen) โดยนำมาทำให้แห้งบดให้ละเอียด สกัดด้วยเมทานอล (ไม่ระบุวิธีการสกัด) นาน 24 ชม. กรอง และระเหยตัวทำละลายออกที่อุณหภูมิ 37 oC นำมาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH assay พบว่าสารสกัดเมทานอลของดอกอัญชันมีค่า IC50เท่ากับ 92.42 มคก./มล. (22)

การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของดอกอัญชันจากจังหวัดเชียงราย (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยการนำดอกอัญชันมาทำให้แห้งโดยการเก็บในความเย็นที่อุณหภูมิ -40oC และนำมาบดให้ละเอียดด้วยโกร่งที่แช่ในไนโตรเจนเหลว นำผงที่ได้ไปแช่แข็ง 24 ชม. และนำมาทำให้แห้งอีกครั้งด้วยอุปกรณ์ Delta 2–24 LSC laboratory scale plus freeze dryer นาน 24 ชม. นำผงแห้ง 5 ก.มาผสมกับน้ำกลั่น 100 มล. และสกัดด้วยวิธี reflux ที่อุณหภูมิ 100 oC นาน 30 นาที ทำให้เย็นที่อุณหภูมิห้อง กรองและนำไปทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธีDPPH assay พบว่าสารสกัดจากดอกอัญชันในขนาด 1 กรัม (น้ำหนักแห้ง) มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเทียบเท่ากับสารมาตรฐาน trolox140.51 มิลลิโมลต่อลิตร (mmol L−1 TE g−1DW)  (48)

2.3 ฤทธิ์ป้องกันรังสียูวีสำหรับผิวกาย (S008)

การทดสอบฤทธิ์ปกป้องเซลล์จากรังสีอัลตร้าไวโอเลต (UV) ของดอกอัญชันจากประเทศไทย (voucher specimen: CT/NNAZ/001) โดยนำผงแห้งของดอกอัญชัน 50 ก. มาสกัดในน้ำที่เพิ่งต้มเดือดใหม่ (freshly boiled deionized water) 500 มล. นาน 30 นาที รอให้เย็นและเขย่าบ่อย ๆ จากนั้นจึงนำไปสกัดด้วยคลื่นเสียงความถี่สูง นาน 15 นาที กรอง 3 ครั้ง นำไปทำให้แห้งด้วยความเย็น (freeze-dried) นำไปทดสอบฤทธิ์ปกป้องเซลล์จากรังสีUV ด้วยวิธี UV-induced mitochondrial DNA (mtDNA) damage assay ในเซลล์ผิวหนังของมนุษย์ (human keratinocytes; HaCaT) พบว่า สารสกัดน้ำจากดอกอัญชันความเข้มข้น 250 มคก./มล. สามารถป้องกัน mtDNA จากการถูกทำลายด้วยรังสี UV ได้ (45)

การศึกษาฤทธิ์ปกป้องรังสีของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มา และ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันแห้ง 10 ก. มาสกัดด้วย 20% เอทานอล 100 ก. ใน ultrasonic bath ที่อุณหภูมิ 25 oC นาน 20 นาที หลังจากนั้นนำมาทำให้เย็นลงที่อุณหภูมิ 22-23 oC กรอง 3 ครั้ง นำมาระเหยตัวทำละลายออกด้วยการลดความดันที่อุณหภูมิ 40 oC นำมาทดสอบหาค่าการป้องกันรังสีUV หรือ sun protection factor (SPF)โดยใช้สารสกัดความเข้มข้น 50 มก./มล. พบว่าสารสกัดดอกอัญชัน มี ค่า SPF ประมาณ 31 (30)

2.4 ฤทธิ์ต้านการอักเสบ (S014)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของดอกอัญชันจากประเทศอินเดีย (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันแห้งมาสกัดด้วยอุปกรณ์ soxhlet extractor โดยใช้ปิโตรเลียมอีเทอร์เป็นตัวทำละลาย ที่อุณหภูมิ 60-80 oC จากนั้นจึงระเหยตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง vacuum evaporator  นำสารสกัดที่ได้มาทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบในหนูแรท โดยแบ่งหนูเป็น 4 กลุ่ม กลุ่มที่ 1 ป้อนน้ำกระสายยา (0.5% tween 80) 1 มล. (กลุ่มควบคุม) กลุ่มที่ 2 และ 3 ป้อนสารสกัดปิโตรเลียมอีเทอร์ของดอกอัญชันขนาด 200 และ 400 มก./กก. ตามลำดับ และกลุ่มที่ 4 ป้อนยามาตรฐาน diclofenac sodium ขนาด 50 มก./กก. จากนั้น หนูทุกกลุ่มจะถูกเหนี่ยวนำให้เกิดการอักเสบด้วยการฉีดสารคาราจีแนนความเข้มข้น 1% ปริมาตร 0.1 มล. เข้าที่บริเวณอุ้งเท้า ประเมินอาการบวมด้วยการวัดขนาดของอุ้งเท้าด้วยเครื่อง plethismometer ที่เวลาก่อนและหลังจากฉีดสารคาราจีแนน 3 ชม. พบว่าสารสกัดปิโตรเลียมอีเทอร์ของดอกอัญชันขนาด 200 และ 400 มก./กก. สามารถลดการบวมของอุ้งเท้าได้ 14% และ 21% ตามลำดับ ในขณะที่ยา diclofenac sodium สามารถลดการบวมของอุ้งเท้าได้ 38% เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมแสดงให้เห็นว่าสารสกัดปิโตรเลียมอีเทอร์ของดอกอัญชันมีฤทธิ์ต้านการอักเสบ แต่ประสิทธิภาพยังน้อยกว่ายามาตรฐานในขนาดที่ทำการทดสอบ การวิเคราะห์ทางเคมีพบว่าสารออกฤทธิ์ในสารสกัดปิโตรเลียมอีเทอร์ของดอกอัญชันคือสาร taraxerol ซึ่งเป็นสารในกลุ่ม pentacyclic triterpenoids(18)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของดอกอัญชันจากประเทศอินโดนีเซีย (ไม่ระบุ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันมาผ่านไอน้ำร้อนอุณหภูมิ 100 oC นาน 6 นาที ทำให้เย็นทันทีโดยการจุ่มลงในอ่างน้ำแข็ง และทำให้แห้งด้วยความเย็น (freeze-dried) บดให้ละเอียด นำผงแห้ง 0.1 ก. มาเติมสารละลายที่มีส่วนผสมของเมทานอล/อะซีโตน/น้ำ (อัตราส่วน 5 : 4 : 1) กวนผสมเป็นเวลานาน 24 ชม. ที่อุณหภูมิห้อง นำไปปั่นและทำให้เข้มข้นด้วยความเร็ว 4,000 รอบ/นาที ที่อุณหภูมิ 45 oC จนตัวทำละลายระเหยไปหมด ซึ่งจะได้สารสกัดหยาบ นำไปสกัดแยกส่วนด้วยเทคนิค solid-phase extraction โดยใช้ SEP Pack C18 cartridge จนได้ ส่วนสกัด phenolic acids (F1), ส่วนสกัด anthocyanins (F2), ส่วนสกัด flavonols (quercetin glycosides; F3), และส่วนสกัด procyanidins/polymeric anthocyanins (ternatin anthocyanins; F4) นำ F3 และ F4 มาทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบในเซลล์แมคโครฟาจชนิด RAW 264.7 ซึ่งถูกเหนี่ยวนำให้เกิดการอักเสบด้วยสาร lipopolysaccharide (LPS) พบว่า F3 ออกฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ cyclooxygenase (COX)-2 ได้ดีและยับยั้งการสร้าง reactive oxygen species (ROS) ได้บางส่วน ในขณะที่ F4 สามารถยับยั้งกระบวนการnuclear factor kappa B (NF-κB) translocation, การแสดงออกของ inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein, และการสร้าง nitric oxide (NO) ผ่านกลไกnon-ROS suppression แสดงให้เห็นว่า สารกลุ่ม quercetin glycosides และ ternatin anthocyanins จากดอกอัญชันมีฤทธิ์ต้านการอักเสบ(21)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสำคัญและสารสกัดดอกอัญชันจากประเทศอินเดีย (voucher specimen: CU/RA/003, Ref. no. CNH/2017/Tech.II/19) โดยนำดอกอัญชันมาผึ่งให้แห้ง บดให้ละเอียด นำผงแห้ง 10 ก. มาแช่ในเมทานอล 30 มล. อุณหภูมิ 30 oC นาน 12 ชม. โดยมีการเขย่า ทำการสกัดซ้ำ 3 ครั้ง กากที่เหลือหลังจากการสกัดครั้งสุดท้าย นำมาเติมเมทานอล 10 มล. รวมสารที่ได้ กรอง นำสารสกัดที่ได้ไปปั่นด้วยเครื่อง centrifuge ความเร็ว 2,000 รอบ/นาที นาน 10 นาที นำส่วนใสไปทำให้แห้ง และนำไปทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบในหนูเม้าส์ โดยป้อนหนูด้วยสารสกัดเมทานอลของดอกอัญชัน (CTE) ขนาด50 มก./กก. หรือสาร quercetin-3β-D-glucoside (QG) ขนาด 2.5 มก./กก. (QG เป็นสารสำคัญในดอกอัญชัน ไม่ระบุแหล่งที่มา)ติดต่อกัน 7 วัน หลังจากการให้สารทดสอบครั้งสุดท้าย 30 นาที หนูจะได้รับการฉีด anti-TNFR1 antibody ขนาด 10 มคก./ตัว เข้าทางหลอดเลือดดำ และหลังจากนั้นอีก 30 นาที จึงเหนี่ยวนำให้เกิดการอักเสบด้วยการฉีดสารคาราจีแนนความเข้มข้น 1%w/v ขนาด 100 มคล. เข้าบริเวณอุ้งเท้าของขาหลังด้านขวา ทิ้งไว้ 12 ชม. จึงวิเคราะห์ผล พบว่าทั้ง CTE และ QG สามารถบรรเทาอาการอักเสบได้ในเวลา 6 – 12 ชม. หลังจากฉีดสารคาราจีแนน นอกจากนี้ยังมีผลยับยั้ง tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1)โดยทำให้polymorphonuclear neutrophil (PMN) infiltration, pro-inflammatory cytokines, chemokines, การสร้าง reactive oxygen species (ROS)/nitrogen species (RNS), ภาวะ oxidative stress, NF-κB mediated COX-2,และการแสดงออก iNOS ลดลงในเวลา 4 - 12 ชม. หลังจากฉีดสารคาราจีแนนโดย QG ออกฤทธิ์ได้ดีกว่า CTE ในขนาดที่ทำการทดสอบ แสดงให้เห็นว่า สารสกัดเมทานอลของดอกอัญชัน และสาร quercetin-3β-D-glucoside ซึ่งเป็นสารสำคัญในดอกอัญชันมีฤทธิ์ต้านการอักเสบ (20)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารสำคัญและสารสกัดดอกอัญชันจากประเทศอินเดีย (voucher specimen: GACBOT-121) โดยนำดอกอัญชันมาผึ่งให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง นำดอกแห้ง 750 ก. มาสกัดโดยการแช่ใน 95% เมทานอล 3 ล. ที่อุณหภูมิห้อง นาน 4 วัน โดยมีการกวนเป็นครั้งคราว กรอง ระเหยตัวทำละลายออกโดยการตั้งบน water bath อุณหภูมิ 45 oC และทำให้แห้งด้วยการลดความดัน ซึ่งจะได้สารสกัดเมทานอล นำสารสกัดที่ได้สกัดแยกส่วน(sequential partition fraction) ด้วยปิโตรเลียมอีเทอร์, คลอโรฟอร์ม, และเอทิลอะซิเตท จากนั้นจึงนำส่วนสกัดคลอโรฟอร์มมาแยกสารสำคัญด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟี และพิสูจน์โครงสร้างด้วยเทคนิคUV, IR, 1H NMR, 13C NMR, และ GC-MS spectroscopic ซึ่งจะทำให้ได้สาร3-deoxy-3, 11-epoxy cephalotaxine ซึ่งเป็นสารในกลุ่มอัลคาลอยด์ นำสารสกัดเมทานอลและสาร3-deoxy-3, 11-epoxy cephalotaxine มาทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบในหนูแรท โดยแบ่งหนูเป็น 6 กลุ่ม กลุ่มที่ 1 และ 2 ป้อนน้ำกระสายยา (1 % DMSO) 10 มล./กก.กลุ่มที่ 3 ป้อนยามาตรฐาน diclofenac sodium ขนาด 100 มก./กก. กลุ่มที่ 4 และ 5 ป้อนสาร 3-deoxy-3, 11-epoxy cephalotaxine ขนาด 100 และ 200 มก./กก. ตามลำดับ กลุ่มที่ 6 ป้อนสารสกัดเมทานอล 300 มก./กก. จากนั้นจึงเหนี่ยวนำให้เกิดการอักเสบด้วยการฉีดสารคาราจีแนนความเข้มข้น 1% ขนาด 0.1 มล. เข้าบริเวณอุ้งเท้าด้านขวาของหนูกลุ่มที่ 2-6 วิเคราะห์ด้วยการวัดขนาดของอุ้มเท้าด้วยเครื่อง plethysmometer ที่เวลา 1, 2, 3, และ 4 ชม. หลังจากฉีดสารคาราจีแนน พบว่าที่เวลา 1, 2, 3, และ 4 ชม. หนูกลุ่มที่ 1 มีขนาดอุ้งเท้า 2.33, 2.33, 2.32, และ 2.31 ซม. ตามลำดับ หนูกลุ่มที่ 2 มีขนาดอุ้งเท้า 3.81, 3.60, 3.52, และ 3.51 ซม. ตามลำดับ หนูกลุ่มที่ 3 มีขนาดอุ้งเท้า 3.85, 3.40, 3.19 และ 2.86 ซม. ตามลำดับ หนูกลุ่มที่ 4 มีขนาดอุ้งเท้า 3.75, 3.59, 3.48 และ 3.44 ซม. ตามลำดับ หนูกลุ่มที่ 5 มีขนาดอุ้งเท้า 3.74, 3.43, 3.06 และ 2.92 ซม. ตามลำดับ หนูกลุ่มที่ 6 มีขนาดอุ้งเท้า 3.79, 3.58, 3.46 และ 2.99 ซม. ตามลำดับ  แสดงให้เห็นว่า สารสกัดเมทานอลของดอกอัญชัน และสาร 3-deoxy-3, 11-epoxy cephalotaxine จากดอกอัญชันมีฤทธิ์ต้านการอักเสบ โดยประสิทธิภาพจะขึ้นกับขนาดที่ให้ (19, 37)

การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของดอกอัญชัน (ไม่ระบุแหล่งที่มาและ voucher specimen) โดยนำดอกอัญชันมาผึ่งให้แห้ง บดให้ละเอียด แช่ในเมทานอล อุณหภูมิ 30 oC นาน 12 ชม. โดยมีการเขย่า ระเหยตัวทำละลายออก และทำซ้ำ 3 ครั้ง กากที่เหลือในครั้งสุดท้าย นำมามาเติมเมทานอล 10 มล. กรอง นำไปปั่นด้วยเครื่อง centrifuge ความเร็ว 2,000 รอบ/นาที นาน 10 นาที เก็บส่วนใส ตั้งทิ้งไว้ให้ตัวทำละลายระเหยออกจนหมด นำไปทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบในหนูเม้าส์ โดยป้อนหนูด้วยสารสกัดเมทานอลขนาด 25, 50, และ 100 มก./กก. ติดต่อกัน 7 วัน จากนั้นจึงฉีดสารคาราจีแนนความเข้มข้น 1% เข้าบริเวณอุ้งเท้าขวาด้านหลัง วิเคราะห์ที่เวลา 0, 2, 4, 6, และ 12 ชม. หลังจากฉีดสารคาราจีแนน พบว่า สารสกัดเมทานอลของดอกอัญชันทุกขนาด สามารถลดอาการบวมที่อุ้งเท้าหนูได้ เมื่อเทียบกับกลุ่มที่ฉีดสารคาราจีแนนเพียงอย่างเดียว โดยขนาด 50 มก./กก. ออกฤทธิ์ได้ดีที่สุด การศึกษากลไกการออกฤทธิ์พบว่า สารสกัดเมทานอลของดอกอัญชันทำให้ PMN, tumor necrosis factors (TNF) α, interferons (IFN)γ, interleukin (IL)-6,C-reactive protein (CRP), •O2-,NO, COX-2, และ iNOS ลดลง และทำให้ IL-10 เพิ่มขึ้น (49)

1 การทดสอบความเป็นพิษแบบเฉียบพลัน

การทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลันของสารสกัดปิโตรเลียมอีเทอร์ของดอกอัญชันในหนูแรท โดยป้อนหนูด้วยสารสกัดขนาด 2,000 มก./กก.เพียงครั้งเดียว พบว่าที่ขนาดดังกล่าว ไม่ก่อให้เกิดความผิดปกติใด ๆ กับสัตว์ทดลอง (18)

การทดสอบความเป็นพิษแบบเฉียบพลันของสารสกัด 95% เมทานอลสารสกัดคลอโรฟอร์ม และสารสกัดเอทิลอะซิเตทของดอกอัญชันในหนูแรท โดยป้อนหนูด้วยสารสกัดขนาด 300 มก./กก. สังเกตอาการ 72 ชม. พบว่าสารสกัดทุกชนิดไม่ทำให้สัตว์ทดลองตายและไม่พบความผิดปกติใดๆ กับสัตว์ทดลอง(42)

การทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลันของสารสกัด 50% เอทานอลของดอกอัญชันในหนูแรท โดยป้อนสารสกัดให้หนูกินในขนาด 2,000 มก./กก. เพียงครั้งเดียว สังเกตอาการอย่างใกล้ชิด 24 ชม. และสังเกตอาการต่ออีก 14 วัน พบว่าสัตว์ทดลองไม่มีความผิดปกติใด ๆ ไม่พบการตาย และไม่พบความผิดปกติของอวัยวะภายใน (50)

การทดสอบความเป็นพิษแบบเฉียบพลันของสารสกัดเมทานอลของดอกอัญชันในหนูเม้าส์ โดยป้อนหนูด้วยสารสกัดขนาด 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000, และ 8,000 มก./กก. เพียงครั้งเดียว สังเกตอาการของสัตว์ทดลองภายใน 72 ชม. พบว่าสารสกัดขนาด 250 - 1,000 มก./กก. ไม่ทำให้เกิดการตายหรือความผิดปกติใด ๆ กับสัตว์ทดลองในระยะเวลาที่ทำการทดสอบ (20)

การทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลันของสาร3-deoxy-3, 11-epoxy cephalotaxine และสารสกัด95% เมทานอลของดอกอัญชันในหนูแรท โดยป้อนหนูด้วยสารสกัดเมทานอลขนาด 300 มก./กก. และสาร3-deoxy-3, 11-epoxy cephalotaxine ขนาด 200 มก./กก.เพียงครั้งเดียว เฝ้าสังเกตอาการ 72 ชม. พบว่าสารทดสอบทั้ง 2 ชนด ไม่ทำให้สัตว์ทดลองมีพฤติกรรมที่ผิดปกติ และไม่พบการตายของสัตว์ทดลอง(19)

การทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลันของสารสกัด 98% เอทานอลของดอกอัญชันในหนูแรท โดยป้อนหนูด้วยสารสกัดขนาด 5, 50, 300, และ 2,000 มก./กก. เพียงครั้งเดียว สังเกตอาการอย่างใกล้ชิด 24 ชม. และสังเกตอาการต่ออีก 14 วัน พบว่าสัตว์ทดลองไม่มีความผิดปกติใด ๆ และไม่พบการตาย (51)

2 การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์

การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารสกัดน้ำของดอกอัญชัน โดยทำการทดสอบในเซลล์ผิวหนังของมนุษย์ (human keratinocytes; HaCaT) ด้วยวิธี MTS assayโดยใช้สารสกัดความเข้มข้น 50-2,000 มคก./มล. พบว่าสารสกัดน้ำของดอกอัญชันที่ความเข้นข้น 50, 100, 250, และ 500 มคก./มล. ไม่เป็นพิษต่อเซลล์ HaCaT แต่ที่ความเข้มข้น 1,000, 1,500, และ 2,000 มคก./มล. มีความเป็นพิษต่อเซลล์ HaCaT(45)

การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารสกัด 20% เอทานอลของดอกอัญชัน โดยทำการทดสอบในเซลล์ผิวหนัง fibroblasts และ keratinocytes โดยใช้สารสกัดความเข้มข้น 50, 250, และ 500 มคก./มล. ทำการทดสอบด้วย alamar blue assay พบว่าสารสกัดดอกอัญชันขนาด 50 มคก./มล. ทำให้อัตราการรอดชีวิตของเซลล์ fibroblasts ลดลง ในขณะที่สารสกัดดอกอัญชันขนาด 250, 500 มคก./มล. ทำให้อัตราการรอดชีวิตของเซลล์ keratinocytes ลดลงการทดสอบด้วย neutral red uptake assay พบว่า สารสกัดดอกอัญชันขนาด 500 มคก./มล. ทำให้อัตราการรอดชีวิตของเซลล์ keratinocytes ลดลง แต่เซลล์ทั้งหมดมีอัตราการรอดชีวิตมากกว่า 90% (30)

3 การทดสอบความเป็นพิษต่ออวัยวะสืบพันธุ์

การทดสอบความเป็นพิษต่ออวัยวะสืบพันธุ์ของสารสกัดน้ำของดอกอัญชัน โดยทำการทดสอบในหนูแรทเพศผู้ โดยป้อนสารสกัดให้หนูกินในขนาด 10, 50, และ 100 มก./กก. นาน 28 วัน ทำการวิเคราะห์ absolute weight และ relative weight ของอัณฑะ (testis), ท่อพักน้ำเชื้อ (epididymis) รวมทั้งจำนวนอสุจิของสัตว์ทดลอง พบว่า สารสกัดน้ำของดอกอัญชันทุกขนาดให้ผลไม่แตกต่างจากกลุ่มควบคุมที่ได้รับน้ำกลั่น แสดงให้เห็นว่าสารสกัดน้ำของดอกอัญชันสีม่วงในขนาดที่ทำการทดสอบ ไม่ก่อให้เกิดความเป็นพิษต่ออวัยวะของระบบสืบพันธุ์ในหนูแรทเพศผู้ (39)

ยังไม่มีรายงานข้อห้ามใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง

ยังไม่มีรายงานข้อควรระวังการใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง

ยังไม่มีรายงานอาการไม่พึงประสงค์จากการใช้ในรูปแบบของเครื่องสำอาง

ผลิตภัณฑ์ cleansing mousse ที่มีสารละลายน้ำหมักดอกอัญชัน (butterfly pea flower fermentation solution) ความเข้มข้น 1.0%, 2.5%, 5.0%, 7.5%, และ 10.0% เมื่อใช้ล้างหน้าทุกวันนาน 28 วัน ทำให้ผิวหน้าขาวขึ้น 7.99%, 10.53%, 18.50%, 22.21%, และ 29.97% ตามลำดับ และทำให้ความชุ่มชื้นบนผิวหน้าเพิ่มขึ้น 10.20%, 14.28%, 15.91%, 19.63%, และ 20.32% ตามลำดับ และเมื่อนำมาพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์มาสก์ (brightening mask) ซึ่งมีส่วมผสมของสารละลายน้ำหมักดอกอัญชัน 6% โดยให้ใช้ทุกวันเป็นเวลานาน 30 วัน จะทำให้ผิวหน้าขาวขึ้น 18.34% และทำให้ความชุ่มชื้นบนผิวหน้าเพิ่มขึ้น 20.35% (29)

สารสกัด 20% เอทานอลของดอกอัญชันความเข้มข้น 10 มก./มล. ขนาด 0.2 มล. เมื่อทาบริเวณท้องแขนของอาสาสมัคร ในขนาดพื้นที่ 2 x 2 ซม. ทิ้งไว้ 30 นาที พบว่าทำให้ผิวมีความชุ่มชื้นเพิ่มขึ้น 10% และช่วยป้องกันการสูญเสียน้ำจากผิวหนังได้ 5-15% (30)

DIP (THAILAND-TH)

USPTO (USA)